在未提取RNA的唾液中检测SARS-CoV-2
Direct One-Step RT-qPCR Mix for SARS-CoV-2可以对未纯化的唾液样本进行精确的一步RT-qPCR,检测病毒的存在和数量。不需要RNA提取步骤;只需将样品与前处理试剂混合,热处理,再与RT-qPCR母混合混合即可。整个协议,从预处理到检测,不到一个小时,使快速结果。本协议为唾液样本中多重SARS-CoV-2检测提供了指南,但不包括引物(请参阅下面的概述部分了解更多信息)。
耶鲁大学医学院最近的研究发现,唾液中高水平的SARS-CoV-2与因严重疾病住院和死亡的可能性增加之间存在直接关联(Silva等,2021年)。这种病毒载量和感染严重程度之间的相关性在鼻咽样本中不存在。这些结果表明,监测唾液中的病毒载量可以更好地了解疾病进展,并可用于对SARS-CoV-2患者进行分层和有效治疗。
概述
我们的一步式PrimeScript III RT-qPCR组合包含市场上最敏感的逆转录酶,优于Qiagen/TaqPath。PrimeScript III混合被广泛认为可以与多种样本类型一起使用,在感染开始时检测低病毒载量,此时只需要进行一次检测。鉴于对唾液样品中SARS-CoV-2快速、准确检测的巨大需求,我们调整并优化了相同的金标准PrimeScript III技术,从唾液粗样品中进行无提取RT-qPCR检测,从而形成了SARS-CoV-2直接一步RT-qPCR Mix。
一步PrimeScript技术已用于两项FDA新冠病毒-19诊断试验的紧急使用授权(EUA)。看法更多的信息在这些EUA上,最近使用该技术检测SARS-CoV-2的出版物,以及与美国疾病预防控制中心、世卫组织、中国疾病预防控制中心和日本NIID提供的引物/探针组相容性数据。
SARS-CoV-2方案的直接一步RT-qPCR混合使用美国疾病预防控制中心推荐的用于多重反应中N1、N2和RNase P靶点的引物和探针进行优化。这些定制引物和探针需要单独订购。
应用程序数据
Direct One-Step PrimeScript RT-qPCR Mix用于SARS-CoV-2的预期应用的性能在一系列目标RNA拷贝数上得到了证实(图1)。
将SARS-CoV-2 N1和N2区的合成RNA插入未纯化的唾液样本中。标本按“SARS-CoV-2直接一步PrimeScript RT-qPCR Mix for SARS-CoV-2”方案处理,含或不含标本准备液(SPS)。经SPS处理的样品均检测出SARS-CoV-2 N1、N2靶点和人RNase P (RP)靶点阳性。另一方面,未经过SPS处理的样品没有获得N1和N2靶点的Ct值(ND),但由于残留的人类基因组DNA, RP靶点的Ct值仍可获得。较高的反应量,允许较高的样本输入,显示出更一致的结果,特别是检测低拷贝数的病毒基因组。
20-µl反应(总体积) | |||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
样品制备液 | 没有 | 是的 | |||||
目标 | N1 | N2 | RP | N1 | N2 | RP | |
靶RNA(拷贝数) | 0 | ND | ND | 27.6 | ND | ND | 24.6 |
10 | ND | ND | 27.5 | 38.1 | 36.4 | 24.8 | |
One hundred. | ND | ND | 27.8 | 34.1 | 32.7 | 24.5 | |
1,000 | ND | ND | 27.9 | 31 | 29.7 | 24.7 | |
10,000 | ND | ND | 27.9 | 27.3 | 26.6 | 24.3 |
50-微升反应(总体积) | |||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
样品制备液 | 没有 | 是的 | |||||
目标 | N1 | N2 | RP | N1 | N2 | RP | |
靶RNA(拷贝数) | 0 | ND | ND | 27.7 | ND | ND | 24.9 |
10 | ND | ND | 27.7 | 36.7 | 36.3 | 25.0 | |
One hundred. | ND | ND | 27.5 | 34.5 | 32.9 | 24.7 | |
1,000 | ND | ND | 27.6 | 30.6 | 29.7 | 24.8 | |
10,000 | ND | ND | 27.7 | 27.1 | 26.5 | 24.9 |
图1。使用SARS-CoV-2的直接一步RT-qPCR混合物,在粗唾液样本中可靠地检测到SARS-CoV-2 RNA。
更多信息
应用
- 未纯化唾液样本中SARS-CoV-2的检测(提供方案)
参考文献
席尔瓦等.唾液病毒载量是COVID-19严重程度和死亡率的动态统一关联。medRxiv10,doi: 10.1101 / 2021.01.04.21249236(2021)。
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