CRISPR筛选确定宿主因子
发现对SARS-CoV-2发病机制至关重要的宿主因素并确定新的治疗靶点
病毒学领域的CRISPR筛选非常适合分析病毒-宿主相互作用;确定病毒进入、复制和传播的关键宿主因素;以及确定和优先考虑新的药物靶点。利用sgRNA文库进行基因组规模的CRISPR/Cas9敲除筛查有助于确定导致疾病反应的重要宿主因素。
这Guide-it-CRISPR全基因组sgRNA文库系统是用于在人细胞系的表型进行敲除画面的汇集慢病毒因组文库。该系统是基于布鲁内洛库(Doench等人2016; Doench等人2018),和包含超过76000导的RNA(sgRNAs)靶向大约19000个基因,每个基因4个高度活性指南,以及非靶向因组控制。将扩增的,经过验证的库被提供为准备使用的冻干转染混合使得能够容易地生产高滴度慢病毒和基因组范围内CRISPR屏幕(图1)的设置的。
图1所示。使用Guide-it CRISPR全基因组sgRNA文库系统进行CRISPR/Cas9全基因组筛选。sgRNA文库系统以单管、冻干混合物的形式提供,其中包含sgRNA载体、Lenti-X包装质粒和Xfect转染试剂。该系统实现了一步高效方案,便于慢病毒生产和转染。
在筛选之后,可以进行下一代测序(NGS)分析,以使用Guide it CRISPR全基因组sgRNA文库NGS分析试剂盒,其中包括必要的引物和试剂,用于从使用我们的全基因组sgRNA文库转导的细胞群中制备Illumina测序就绪NGS文库。
质量控制,以确保因组表示
我们的文库经过精心制作,以确保正确的sgRNA表达。我们在文库合成、扩增、病毒产生和靶细胞转导的每一步都测量了sgRNA表达(图2)。
图2。在Guide it CRISPR全基因组sgRNA文库系统中表达sgRNA。小组A.指南表示质粒库。基于布鲁内洛-因组文库中克隆到pLVXS-因组-mCherry的-HYG载体和放大。质粒DNA库中的sgRNAs的表示通过NGS验证。的库中的所有陈述sgRNAs> 90%的表示为10倍的分布范围内。条表示用特定sgRNAs的读取数量计数。B小组。引导表示在质粒文库和转导的细胞的比较。基因组DNA从Cas9 + / +因组上A375潮霉素筛选的细胞中分离,然后PCR扩增。将PCR产物进行测序,以确定每个集成因组相对于起始质粒DNA人口的读取计数。我们观察到强的Spearman和Pearson相关性,表明该系统是能够保持在转导的和选定的细胞群体因组表示。
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使用全基因组CRISPR筛查进行病毒学研究的实例
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工具书类
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多恩奇,J.G。等等。我准备好接受CRISPR了吗?基因筛查用户指南。纳特。牧师。吉内特。19,67–80 (2018).
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