获得预放大的好处,同时保持统一的代表性
传统qPCR检测不到的有限样本可通过预放大成功分析(图1)。在本实验中,通过PrimerArray细胞周期(人类)面板(Cat.#PH002)分析了人类通用快速克隆II cDNA(Cat.#637260),该面板包含88个与细胞周期相关的基因和8个管家基因。使用100 pg未经预扩增的cDNA(紫色)或100 pg cDNA(使用Prelude PreAmp Master Mix(蓝色)进行10次预扩增)进行实验。值得注意的是,从100 pg的非扩增cDNA中检测到的96个基因中只有一小部分是可检测到的(CT值<32)。然而,在qPCR之前的10个周期的预扩增大大改善了这些数据,现在所有96个基因都显示CT值介于17和30之间(图1,蓝色)。
![图1所示。预放大的好处。](//www.yamajr.com/learning-centers/real-time-pcr/technical-notes/images/550-qPCR/CC-TechFigs/PreAmp_mastermix_TN_figure_1_8692_T.png)
图1所示。预放大的好处。请注意,尽管上面的图表显示了PrimerArray细胞周期(人类)面板中所有96个目标基因的数据,但只有部分基因名称显示在x轴上,以确保其可读性。可以找到目标基因的完整列表在这里. 带有C的非流化基因的数据点T>32未显示。
还必须确保预放大不会引入偏差。例如,在预扩增后,图1中的一些基因显示CT数值<20。进行以下实验以确定这是否是由于优先选择这些引物的偏倚扩增,或者这些基因是否仅在起始样本中以更高水平表达:使用Prelude PreAmp Master Mix(蓝色)预扩增10个周期的100 pg cDNA与20 ng cDNA(紫色)进行比较使用相同的细胞周期面板(图2),未对其进行预放大。关键的是,CT所有96个基因的值高度相似,表现出一致的代表性。因此,使用Prelude PreAmp Master Mix进行10个预扩增周期,可以使用qPCR检测100 pg的起始cDNA,而不会引入偏差并保持一致的表达。
![图2。预放大后的统一表示。](//www.yamajr.com/learning-centers/real-time-pcr/technical-notes/images/550-qPCR/CC-TechFigs/PreAmp_mastermix_TN_figure_2_8693_T.png)
图2。预放大后的统一表示。请注意,尽管上面的图表显示了PrimerArray细胞周期(人类)面板中所有96个目标基因的数据,但只有部分基因名称显示在x轴上,以确保其可读性。可以找到目标基因的完整列表在这里.
在极端情况下,无论是低样本输入还是相对低拷贝数的基因,都可能需要进行14个预扩增周期,而不是10个。如前所述,更多的周期会产生更多的偏差。为了解决这一问题,使用Prelude前置放大器主成分混合物对100 pg cDNA进行10个周期(蓝色)或14个周期(紫色)的预扩增,并在与之前相同的细胞周期面板上进行分析。值得注意的是,将预放大周期的数量从10个增加到14个,保持了统一的表示(图3)。
![图3。10或14个预放大周期后的均匀性。](//www.yamajr.com/learning-centers/real-time-pcr/technical-notes/images/550-qPCR/CC-TechFigs/PreAmp_mastermix_TN_figure_3_8694_T.png)
图3。10或14个预放大周期后的均匀性。请注意,尽管上面的图表显示了PrimerArray细胞周期(人类)面板中所有96个目标基因的数据,但只有部分基因名称显示在x轴上,以确保其可读性。可以找到目标基因的完整列表在这里.
为了进一步证明均匀性,我们进行了delta-delta C测试T(ΔCT解析CT由10循环和14循环预放大产生的值。差值小于±0.75是确保无偏差放大的最严格方法之一。关键的是,所有96个基因都满足了这一要求(图4),证明了Prelude PreAmp Master Mix在不引入偏差的情况下提供了出色的100 pg的cDNA预扩增,即使进行多达14个周期的预扩增。
![图4.ΔCt分析显示10到14个周期之间无偏预放大。](//www.yamajr.com/learning-centers/real-time-pcr/technical-notes/images/550-qPCR/CC-TechFigs/PreAmp_mastermix_TN_figure_4_8695_T.png)
图4。ΔCT分析表明在10到14个周期之间无偏预放大。请注意,尽管上面的图表显示了PrimerArray细胞周期(人类)面板中所有96个目标基因的数据,但只有部分基因名称显示在x轴上,以确保其可读性。可以找到目标基因的完整列表在这里.
用少于100 pg的起始材料进行预放大
如上所述,Prelude PreAmp Master Mix可以对100 pg的cDNA进行14个循环的预扩增而不引入偏置。然而,没有商业上可用的预放大混合显示较低的投入,许多需要多达1 ng的投入。基于Prelude PreAmp Master Mix的性能,它甚至可以用于初始材料小于100 pg的情况,这可能发生在有限或珍贵的样本,如FFPE组织和液体活检,或罕见的目标,如循环或无细胞DNA。为了证明这一点,使用Prelude PreAmp Master Mix对12.5 pg、50 pg或100 pg的cDNA进行14个循环的预扩增。这些样本随后使用相同的96靶细胞周期面板进行分析。不管起始输入量如何,所有基因都保持了一致的表达,没有引入偏置(图5)。由于Prelude PreAmp Master Mix可以在12.5 pg的起始材料中工作,因此它提供了无与伦比的灵敏度。
![图5。使用12.5 pg的起始材料进行灵敏、无偏的预放大。](//www.yamajr.com/learning-centers/real-time-pcr/technical-notes/images/550-qPCR/CC-TechFigs/PreAmp_mastermix_TN_figure_5_8696_T.png)
图5。使用12.5 pg的起始材料进行灵敏、无偏的预放大。请注意,尽管上面的图表显示了PrimerArray细胞周期(人类)面板中所有96个目标基因的数据,但只有部分基因名称显示在x轴上,以确保其可读性。可以找到目标基因的完整列表在这里.
无与伦比的性能,当与其他预放大混合
在进行预放大时,有多种主混音可供选择。前奏前置放大器主混合的设计,以提供最好的前置放大与最小的偏差量。为了比较Prelude PreAmp Master Mix与其他领先的预扩增混合剂的性能(图6),使用96靶细胞周期面板,将10 pg的cDNA与Prelude PreAmp Master Mix [TBU]进行10或14周期的预扩增。另外三种主混合(TaqMan PreAmp master Mix [ABI]、SsoAdvanced PreAmp Supermix [BioRad]和PerfeCTa PreAmp Supermix [Quanta])也使用制造商推荐的协议进行了测试。ΔΔCT采用GAPDH作为正态化器计算。使用±0.75阈值来确定扩增是否无偏性(表I)。值得注意的是,Prelude PreAmp Master Mix表现最好,有92/96个检测在±0.75范围内(96%)。其他主混合不能匹配,有些只放大了75%的测定没有偏差。因此,前奏PreAmp大师混合提供了无偏预放大的最终信心从有限的样品。
![图6。Takara前置放大器主混合提供较少的偏见前置放大比其他主混合。](//www.yamajr.com/learning-centers/real-time-pcr/technical-notes/images/550-qPCR/CC-TechFigs/PreAmp_mastermix_TN_figure_6_8697_T.png)
图6.前奏前置放大器主混音比其他主混音提供更少的偏置前置放大。请注意,尽管上面的图表显示了PrimerArray细胞周期(人类)面板中所有96个目标基因的数据,但只有部分基因名称显示在x轴上,以确保其可读性。可以找到目标基因的完整列表在这里.
产品 |
不。化验在±0.75 |
百分比偏差 |
前奏前置放大器大师混合 |
92/96 |
4% |
塔克曼前置放大器主混音 |
87/96 |
9% |
高级前置放大器Supermix |
72/96 |
25% |
正序连赢前置放大器SuperMix |
73/96 |
24% |
表一:前奏前置放大器主混音显示的偏差小于其他前置放大主混音。
FFPE组织中162个乳腺癌相关基因的优良预扩增
Prelude PreAmp Master Mix还使用FFPE组织上的162靶标乳腺癌面板进行了测试。用NucleoSpin totalRNA FFPE (Cat.)从FFPE组织样品中提取RNA。# 740982.10)和cDNA生成使用PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) (Cat。# RR036A)。然后用Prelude PreAmp Master Mix对cDNA进行14个周期的预扩增。然后使用定制的162靶标乳腺癌面板对预扩增产物进行分析,并使用SmartChip TB绿色基因表达主混合(Cat。# 640211)的智能芯片实时PCR系统(Cat。# 640022)。ΔΔCT值的计算使用6个内部管家基因的中位数作为一个正常化器,并绘制了面板中所有检测的值(图7)。阈值为±1.5 CT由于分析性能和样品质量的高度可变性,用于确定扩增是否无偏。值得注意的是,在具有挑战性的样本类型FFPE组织中对如此大量的靶点进行预放大,导致很少的预放大偏差,97%的分析(162中的157)在可接受的阈值范围内。
![图7.在FFPE组织中检测162个乳腺癌靶点时,Takara前置放大器主混合物提供高度无偏的前置放大。](//www.yamajr.com/learning-centers/real-time-pcr/technical-notes/images/550-qPCR/CC-TechFigs/PreAmp_mastermix_TN_figure_7_8698_T.png)
图7。Prelude PreAmp Master Mix在FFPE组织中检测162个乳腺癌靶点时提供高度无偏的预放大。
根据制造商的建议,使用TaqMan前置放大器主混音进行了类似的实验。ΔΔCT再次使用六个内部管家基因的平均值作为标准化因子计算值,并绘制面板中所有分析的图(图8)。阈值为±1.5摄氏度T由于分析性能和样品质量的高度可变性,用于确定扩增是否无偏。随后的分析表明,使用该混合物的预扩增更具偏差,只有91%的目标落在使用Prelude前置放大器主混合物时观察到的偏差量±1.5倍的阈值内。因此,与TaqMan前置放大器主混音相比,Prelude前置放大器主混音性能更好,因为前置放大偏差较小(表II)。
![图8。在FFPE组织中检测162个乳腺癌靶点时,TaqMan PreAmp Master Mix比Takara PreAmp Master Mix表现出更大的偏差。](//www.yamajr.com/learning-centers/real-time-pcr/technical-notes/images/550-qPCR/CC-TechFigs/PreAmp_mastermix_TN_figure_8_8699_T.png)
图8。在FFPE组织中检测162个乳腺癌靶点时,TaqMan前置放大器主混合比Prelude前置放大器主混合显示更多的偏差。
产品 |
不。化验在±1.5 |
百分比偏差 |
前奏前置放大器大师混合 |
157/162 |
3% |
塔克曼前置放大器主混音 |
142/162 |
9% |
表二。前奏前置放大器主混合提供更多的无偏前置放大比TaqMan前置放大器主混合。