PC-3-DR细胞转染干扰序列siRNA(对照组)或siRNA,以导致LEDGF/p75的瞬时敲除(PSIP1).根据标准方案,使用PrimeScript RT master mix对提取的RNA进行反向转录。cDNA用于qPCR以定量瞬时LEDGF/p75耗竭。
结果(图1)表明,cDNA产物是从反转录反应中获得的,并且这些产物可以用针对该基因的特异性引物通过qPCR进行分析PISP1基因(199bp)。数据证实转染siRNA的PC-3-DR细胞中LEDGF/p75表达下调54.5%PISP1与转染对照组干扰siRNA的细胞相比。
![GAPDH和RNase P的实时PCR扩增曲线](//www.yamajr.com/learning-centers/real-time-pcr/technical-notes/images/550-qPCR/CC-TechFigs/SIRNA_TN01_99358.jpeg)
图1所示。qPCR检测LEDGF/p75基因敲除。条形图显示了在阴性对照(对照)或靶向siRNA构建(敲除)存在的情况下LEDGF/p75 mRNA的标准化表达水平。
qPCR数据 |
象征 |
控制 |
击倒 |
ΔCt K.D |
ΔCt con |
ΔCt |
2^(–ΔCt) |
上/下 |
|
井1 |
井2 |
井3 |
平均值 |
井1 |
井2 |
井3 |
平均值 |
GOI-HKG |
GOI-HKG |
KD-Con |
褶皱 |
章程 |
LEDGF/p75 |
23.4 |
24.38 |
24.03 |
23.937 |
18.88 |
21.77 |
19.79 |
20.15 |
7.44 |
6.31 |
1.137 |
0.455 |
–2.199 |
GAPDH |
15.68 |
16.23 |
17.57 |
16.493 |
14.02 |
13.73 |
13.77 |
13.84 |
0.00 |
0.00 |
0 |
|
|
图2。qPCR数据。