常见问题
实时PCR(也称为qPCR)和实时逆转录PCR(也称为RT-qPCR或实时RT-PCR)广泛应用于基因分型、基因表达分析、miRNA和非编码RNA分析以及许多其他用途。qPCR和RT-qPCR的有效使用需要可靠的试剂以及对实验设计和数据分析方法的理解。
此处提供了有关qPCR和RT qPCR的常见问题解答。有关更多信息,请参阅用于qPCR和RT qPCR的特定Takara Bio产品的技术文献和网页。
RT-qPCR
您如何决定一步和两步RT qPCR?
一步RT-qPCR | 两步RT-qPCR | |
---|---|---|
程序概述: | 使用基因特异性引物进行反转录,并允许对特定基因进行高度敏感的检测。 | 允许使用识别所有mRNA分子的通用引物(如随机六聚体或寡核苷酸dT引物)通过反转录制备总cDNA。所得cDNA可用于检测多种转录物。 |
当反应中总RNA过多时: | 即使存在大量总RNA,也能提供高效扩增。 |
由于引物可用性不足,使用随机6-mers进行反转录可能导致反应效率低下。 在这种情况下,我们建议使用oligo dT引物进行两步RT-qPCR,而不是随机6-mers。与一步RT-qPCR相比,使用oligo-dT引物可以提高效率并提供类似的结果。 注:当扩增寡核苷酸dT引物RT产生的cDNA时,PCR扩增子应位于预期cDNA的3'端附近。 |
程序优势: | 分析单个基因。 |
分析大量基因的表达。 |
对于许多样本的高通量分析或稀有转录物的精确检测,建议采用一步RT-qPCR方案。一步RT-PCR的另一个优点是存在单管工作流程,避免了在程序中途添加额外试剂的需要,从而降低了污染风险。
有关更多信息,请查看我们的BioView博客帖子“选择正确协议的一步与两步RT qPCR技巧".
对于制备RT-qPCR校准曲线,RNA或cDNA,哪一个是更好的起始样品?
RT-qPCR的校准曲线可通过以下任一方法制备:
- 连续稀释RNA,然后进行逆转录和实时PCR
- 连续稀释cDNA(通过逆转录反应获得),然后进行实时PCR
由于这两种方法评估的参数不同,因此选择适合所用实验系统的方法非常重要。从稀释的RNA样品制备的校准曲线不仅反映了PCR扩增效率的差异,而且还反映了反转录效率的差异,这取决于RNA的数量。根据此类校准曲线确定的PCR扩增效率可能与实际效率不同。
对于绝对定量而言,反转录效率至关重要。因此,使用连续稀释的RNA制备校准曲线(cDNA稀释不合适)。
对于相对定量,可以通过分析参考基因(如管家基因)来校正逆转录效率的差异。建议使用连续稀释的cDNA制备校准曲线。
如何避免总RNA样本中的基因组DNA扩增?
为避免总RNA样本中的基因组DNA扩增:
- 设计避免基因组扩增的引物:选择一个大的内含子区域,并在内含子上游和下游的外显子中设计正向和反向引物。通过这种策略,大的内含子不能进行基因组扩增。当内含子很小时,可以根据熔化温度的差异来区分基因组扩增不同放大倍数的结果(熔融曲线)。
- 对于缺少内含子或基因组结构未知的基因,用DNase I处理总RNA以去除基因组DNA。
- 使用带gDNA橡皮擦的PrimeScript RT试剂盒(完美实时)(类别#RR047A)。该试剂盒中的gDNA擦除器仅在2分钟内去除基因组DNA,然后进行15分钟的反转录反应。由此产生的cDNA可以使用Takara生物芯片进行扩增qPCR预混料.
靶基因表达水平通常被标准化为“管家基因”(参考基因)的表达,以校正输入RNA量的差异和反应效率的变化。如何选择合适的管家基因?
没有一个单一的、普遍适用的管家基因适合在每个实验条件下进行精确的标准化,因为在所用的实验系统中,选择表达水平不发生变化的管家基因非常重要。过去常用的管家基因包括GAPDH和β-肌动蛋白;然而,近年来的报告表明,这些基因的表达也可能有所不同,这取决于样本类型和/或实验条件。
使用多个管家基因进行正常化是目前最可靠的方法。在这种策略中,对多个管家基因的表达进行分析,并选择表现出最低水平变异的基因进行使用。已经开发了用于选择最佳校正基因的软件(例如geNorm和BestKeeper)。如果可用,也可以从微阵列或RNA-seq表达谱数据进行推断。
有关更多信息,请参阅:J.Vandesompele,等(2002)通过对多个内部控制基因进行几何平均,实现实时定量RT-PCR数据的精确标准化。基因组生物学。3.(7) :Research 0034.1–11。
qPCR实验设计与数据分析
建议使用什么样的标准样品来制备校准曲线?
合适的标准样品是那些尽可能接近实际样品的样品。对于基因表达分析研究,使用从已知目标基因表达条件下采集的样本制备的cDNA。对于基因组分析研究,使用基因组DNA。
不建议使用人工标准样品(如质粒DNA)。即使扩增子序列相同,模板组成的任何实质性差异都可能导致不同的PCR扩增效率(如基因组DNA与质粒DNA)。
应使用什么方法分析qPCR扩增产物?
使用经验证的底漆时,先前的熔融曲线分析(Tm值)可作为参考。如果Tm值与过去观察到的值相同,则可以合理地假设PCR产物与过去获得的产物相同。
然而,请记住,尽管相同的PCR产物将显示相同的Tm值,但获得相同的Tm值单独地不一定确认PCR产物完全相同。应使用独立的确认方法;首次使用引物时,请进行电泳以确认实时PCR扩增产物为预期大小。
适当的复制次数(n)是多少?
所需的样本重复次数(n)因实验系统而异。原则上,当预计实验误差相对较大时,应使用较大数量的样本。
- 当通过RT-qPCR分析基因表达时,制备多个生物重复和进行多个RNA提取以确定生物变异程度是有用的。
- 就qPCR而言,当使用低水平的模板时,预计会有更大的可变性,因为检测所需的周期数将很高。在这种情况下,使用更多的复制品。
qPCR的灵敏度是多少?
qPCR的灵敏度取决于实验条件,如使用的试剂和引物。适当设计的系统已证明能够检测到约10份模板。
我知道有两种方法可以确定Ct值。它们是什么?
Ct值可通过两种不同的方法确定:
- 交叉点法将Ct值定义为放大曲线和阈值线之间的交叉点。
- 二阶导数最大值法将Ct值定义为放大曲线(二阶微分曲线)二阶导数最大值的点。
后一种方法允许进行高度精确的分析,因为Ct值通过设置阈值固定,并且不受仪器特定检测可变性的影响。
请注意,某些仪器系统不允许在交叉点法和二阶导数最大值法之间进行选择。
绝对量化和相对量化之间有什么区别?
- 绝对量化使用具有已知拷贝数的标准样本确定目标的绝对数(即拷贝数)。
- 相对量化允许样本之间进行相对比较。
通常,使用相对量化,同时分析待量化的目标基因和参考基因(例如,管家基因)以进行校正(标准化)。相对定量提供未知样本与对照样本表达水平的差异。
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