质谱(MS)是蛋白质组学中使用的主要分析技术,以及来自各种生物和细胞类型的蛋白质的表征。MS分析中最重要的步骤是样品制备,其需要将蛋白质转化为肽。胰蛋白酶是最常用的蛋白质蛋白质消化蛋白质以制备用于分析的肽。它是一种高度特异性的丝氨酸蛋白酶,其在赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧切割,产生最佳尺寸的肽MS分析。快速和完全的消化对于详细的蛋白质表征是重要的。gydF4y2Ba
目前样品制备的做法是在37°C的溶液中胰酶消化过夜。长时间的蛋白质消化可能导致氧化或其他蛋白质修饰,导致灵敏度差,从而使溶液消化的可重复性降低,不适合自动化。此外,溶液中胰蛋白酶消化不能完全消化蛋白质,影响了质谱分析中的蛋白质鉴定。gydF4y2Ba
Capturem胰蛋白酶gydF4y2Ba提供快速、高效和完全的蛋白质样品消化,允许在室温下不间断的MS工作流程进行下游蛋白质分析。本产品采用我们的新型捕获技术,采用自旋柱形式,膜固定化胰蛋白酶。捕获胰蛋白酶色谱柱可用于在不到一分钟的时间内完全消化蛋白质样品,消化效率(蛋白质覆盖率)与溶液中胰蛋白酶消化获得的相当或更好。快速的蛋白质消化不仅节省时间,而且通过减少胰蛋白酶的自溶来提高蛋白质组学分析中肽和蛋白质的鉴定。gydF4y2Ba
技术说明gydF4y2Ba
蛋白和全细胞裂解物的捕获胰蛋白酶技术消化gydF4y2Ba
Capturem胰蛋白酶gydF4y2Ba
特色产品:gydF4y2Ba♦gydF4y2BaCapturem胰蛋白酶gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
利用捕获胰蛋白酶快速完全消化蛋白质gydF4y2Ba
使用Apomyoglobin(APO),肽映射的常见标准,我们将溶液胰蛋白酶消化的效率与Capturem Trypsin方法进行了比较。APO缺乏二硫键,因此在酶消化前不需要变性和/或减少。胰蛋白酶消化的完整性通常用作消化效率的衡量标准。图1显示,在500个离心后,用Capturem Trypsin消化100%的APO样品gydF4y2BaggydF4y2Ba1分钟(C图),相比之下,在溶液胰蛋白酶消化16小时后,只有70%的载脂蛋白样本显示完整载脂蛋白的显著峰值(B图)。gydF4y2Ba
图1所示。用捕获胰蛋白酶快速完全消化载脂蛋白(Apo)。gydF4y2Ba用反相HPLC(RP-HPLC)分析以比较未消化的ApogydF4y2Ba(面板)gydF4y2Ba载脂蛋白在室温下用溶液胰蛋白酶消化16小时gydF4y2Ba(面板B)gydF4y2Ba载脂蛋白在捕获胰蛋白酶柱上消化小于1分钟gydF4y2Ba(面板C)。gydF4y2Ba柱活化、蛋白质消化和RP-HPLC分析按照以下方法部分所述进行。gydF4y2Ba
用捕获胰蛋白酶消化紧密折叠的蛋白质gydF4y2Ba
溶液中胰蛋白酶消化的另一个限制是,如果没有额外的样品处理步骤,如变性和还原,它就不能消化高度折叠的蛋白质。肌红蛋白(Myo)是一种紧密折叠的球状蛋白,在使用溶液胰蛋白酶时消化不良。如图2所示,一个捕获胰蛋白酶柱从Myo酶解中产生了许多蛋白水解肽,在500的单次旋转gydF4y2BaggydF4y2Ba相比之下,溶液中胰酶消化16小时(图B)没有产生任何蛋白水解肽,大部分Myo仍未消化。gydF4y2Ba
图2。用捕获型胰蛋白酶对紧密折叠的肌红蛋白(Myo)进行蛋白水解。gydF4y2Ba采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析未消化的MyogydF4y2Ba(面板)gydF4y2BaMyo在室温下用溶液胰蛋白酶消化16小时gydF4y2Ba(面板B)gydF4y2Ba和Myo消化在Capturem trypsin柱上少于1分钟gydF4y2Ba(面板C)。gydF4y2Ba柱活化、蛋白质消化和RP-HPLC分析按照以下方法部分所述进行。gydF4y2Ba
用捕获型胰蛋白酶消化的蛋白质的质谱分析gydF4y2Ba
除了确定酶切的完整性,测量产生的多肽的序列覆盖率还提供了另一种评估胰酶切效率的方法。为了确定Capturem Trypsin如何有效地生成提供良好序列覆盖的多肽,我们对Capturem Trypsin消化的载脂蛋白进行了质谱(MS)分析。图3为Capturem Trypsin酶切载脂蛋白的解卷积ESI-Orbitrap质谱图。500度离心一次gydF4y2BaggydF4y2Ba静置1分钟可使载脂蛋白完全消化。MS分析鉴定出26个载脂蛋白肽段,其中7个肽段覆盖了100%的氨基酸序列。gydF4y2Ba
图3。用质谱法分析捕获胰蛋白酶生成的载脂蛋白肽。gydF4y2Ba利用Xtract软件,在Capturem Trypsin柱上酶切载脂蛋白生成反卷积的ESI-Orbitrap质谱。数据好心提供:Merlin Bruening博士,University of Notre Dame。gydF4y2Ba
用捕获胰蛋白酶消化的全细胞裂解液的蛋白质组学分析gydF4y2Ba
我们使用Capturem Trypsin对BT474导管乳腺癌细胞的全细胞裂解液进行蛋白质组学分析,以识别尽可能多的独特蛋白。变性的全细胞裂解液用反相高效液相色谱法(图4,图A)分离成19个分离馏分,每个馏分用Capturem Trypsin酶切。表1提供了使用捕获型胰蛋白酶消化的每个馏分的蛋白质量。在分离的LC/MS-MS运行中分析每个馏分的消化蛋白。图4,面板B显示了每个馏分鉴定的独特蛋白质的数量。总的来说,使用Capturem Trypsin消化酶对BT474细胞进行蛋白质组学分析,共鉴定出2,320个独特的蛋白质。gydF4y2Ba
表1。用于捕获胰蛋白酶消化的每馏分的蛋白质量gydF4y2Ba | |||
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分数gydF4y2Ba | 蛋白质数量(µg)gydF4y2Ba | 分数gydF4y2Ba | 蛋白质数量(µg)gydF4y2Ba |
1gydF4y2Ba | 32.22gydF4y2Ba | 11gydF4y2Ba | 35.19gydF4y2Ba |
2gydF4y2Ba | 35.08gydF4y2Ba | 12gydF4y2Ba | 33.12gydF4y2Ba |
3.gydF4y2Ba | 33.75gydF4y2Ba | 13gydF4y2Ba | 26.88gydF4y2Ba |
4gydF4y2Ba | 41.76gydF4y2Ba | 14gydF4y2Ba | 31.88gydF4y2Ba |
5gydF4y2Ba | 41.76gydF4y2Ba | 15gydF4y2Ba | 29.41gydF4y2Ba |
6gydF4y2Ba | 38.21gydF4y2Ba | 16gydF4y2Ba | 26.48gydF4y2Ba |
7gydF4y2Ba | 38.21gydF4y2Ba | 17gydF4y2Ba | 25.98gydF4y2Ba |
8gydF4y2Ba | 38.40gydF4y2Ba | 18gydF4y2Ba | 24.63gydF4y2Ba |
9gydF4y2Ba | 30.32gydF4y2Ba | 19gydF4y2Ba | 21.48gydF4y2Ba |
10gydF4y2Ba | 35.23gydF4y2Ba |
图4。用Capturem胰蛋白酶消化的BT474全细胞裂解物的蛋白质组学分析。gydF4y2Ba裂解液采用反相高效液相色谱法进行分离gydF4y2Ba(面板)gydF4y2Ba将其分解为19个分离馏分,分别用胰酶酶切,然后用LC/MS-MS进行分析,方法部分将详细描述。每个馏分中含有两个或两个以上独特多肽的总蛋白数,如方法部分所述,并绘制在图上gydF4y2Ba(面板B)。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba
Capturem胰蛋白酶提供比溶液中胰蛋白酶消化更快和更完整的消化,防止因蛋白质消化时间过长和/或不完全而导致的灵敏度和再现性损失。Capturem胰蛋白酶消化的优越速度和完整性在两种方法用于消化载脂肌红蛋白(一种用作蛋白质图谱标准模型的蛋白质)时得到证明。Capturem胰蛋白酶在消化肌红蛋白(一种紧密折叠的蛋白质)方面也更有效。进一步使用质谱分析Capturem胰蛋白酶消化液中的载脂肌红蛋白,证实消化液产生的肽具有良好的序列覆盖率。Capturem胰蛋白酶对复杂样品(使用RP-HPLC分离的全细胞裂解液)进行消化,可使用LC/MS-MS分析鉴定2320种独特蛋白质。这些能力使Capturem胰蛋白酶成为蛋白质组分析的有力工具。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
利用捕获胰蛋白酶消化载脂蛋白和MyogydF4y2Ba
Apo(80µg)或Myo(10µg)先在200µl的10 mM碳酸氢铵中溶解后再消化。将试剂盒中包含的200µl活化缓冲液装入色谱柱上,然后在500离心gydF4y2BaggydF4y2Ba然后将载脂蛋白或Myo溶液加载到活化柱上,在500℃下单独离心gydF4y2BaggydF4y2Ba洗脱后的多肽经下游反相高效液相色谱和质谱分析。gydF4y2Ba
用溶液中胰蛋白酶消化载脂蛋白和MyogydF4y2Ba
将Apo(80µg)或Myo(10µg)溶解于200µl 10 mM碳酸氢铵中,用于溶液中胰蛋白酶消化。胰蛋白酶以1:20(w/w)的酶底物比用于消化4µg Apo或0.5µg Myo。反应混合物在室温下培养约16小时。gydF4y2Ba
酶解载脂蛋白和肌醇的反相高效液相色谱分析gydF4y2Ba
反相高效液相色谱分析采用Rainin Dynamax高效液相色谱系统。分析进行了在215 nm Aeris 3.6µm 100肽XB-C18, 50 x 4.6毫米列(Phenomenex)使用梯度洗脱,有两个解决方案:方案一:组织95%乙腈+水+ 5% 0.1% (v / v)和解决方案B:组织10%乙腈+水+ 90% 0.085% (v / v)。采用以下梯度程序:95% A 2 min, 5-60% B 24 min, 60-70% B 1 min, 70% B 2 min。注射前用95% A平衡5 min。注射量为20µl。gydF4y2Ba
胰酶酶切载脂蛋白的质谱分析gydF4y2Ba
对于直接输注MS,洗脱多肽用SpeedVac干燥,在1%乙酸中49% H重组gydF4y2Ba2gydF4y2BaO和50%的甲醇。然后将40µl的重组样品装入Whatman Multi-Chem 96孔微孔板(Sigma-Aldrich),并用特富龙超薄密封带(Analytical Sales and Services)密封。使用Advion Triversa Nanomate纳米电喷雾电离(nESI)源(Advion)将样品引入高分辨率、精确质量的LTQ Orbitrap Velos质谱仪(Thermo Fisher Scientific)中,该质谱仪配备了双压离子阱、HCD电池和ETD。喷雾电压为1.4 kV,气体压力为1.0 psi。离子源界面入口温度为200℃,S-Lens值为57%。在m/z范围为300- 1800的正电离模式下获得高分辨率质谱,使用FT分析仪的质量分辨能力为100,000。光谱是100次扫描的平均值。分析>为峰值强度1%和信噪比>3的信号。肽鉴定使用ProteinProspector (v 5.14.1,加州大学旧金山分校)手工完成。分析中最多包含5个漏失解理。 Mass tolerance was set to 10 ppm. The mismatch was set to 2.
BT474全细胞裂解液的蛋白质组学分析gydF4y2Ba
使用洛杉矶南加州大学Kian Kani教授实验室的BT47 4导管乳腺癌细胞制备的全细胞裂解物进行蛋白质组学分析。简而言之,BT474细胞在PBS(1%OG)中裂解,并添加完整的蛋白酶和磷酸酶抑制剂。然后在PBS/OG中最终浓度为6 M的盐酸胍中对细胞进行还原(5 mM DTT)和烷基化(50 mM IAA)。在数据依赖模式下,使用液相色谱/串联质谱(LC/MS-MS)进行蛋白质鉴定。为了降低样品的复杂性,通过注射2 mg蛋白质裂解物(在PBS中的3M盐酸胍中)并每30秒收集1 ml组分,对总共19个分离组分进行初始RP-HPLC蛋白质分馏,然后将其冷冻,并用SpeedVac干燥。将每一部分重新悬浮在100 mM碳酸氢铵缓冲液中,pH值为8.0,含有1 M尿素+1%乙腈(ACN),总体积为200µl。按照Capturem胰蛋白酶方案一目了然的描述,使用Capturem胰蛋白酶柱单独消化各部分,并向各柱洗脱液中添加2µl乙酸以终止消化反应,然后使用C18 ZipTip过滤器进行清洗,冷冻,并使用SpeedVac干燥。gydF4y2Ba
每部分重悬于25µl, 95/5/0.1 HgydF4y2Ba2gydF4y2BaO/ACN/FA(约为2µg/µl)。质/女士是由注入每个resuspended分数10µl LTQ-FTICR或LTQ-ORBITRAP质谱仪(Thermo-Finnigan)耦合nanoflow色谱系统(Eksigent)和一个25厘米的列(Picofrit 75µm ID、新的目标)内部充满了MagicC18树脂(Michrom生物),在90 -最小线性渐变。对19个样本按随机顺序进行MS。获取的数据由计算蛋白质组学分析系统自动处理。串联质谱与3.13版本的人类国际蛋白质索引数据库(60,428个蛋白条目)进行比对,其中添加了5个人类和牛胰蛋白酶的序列。搜索是和X一起进行的!串联(2005.12.01)。搜索过程中前体离子的质量容限为1个AMU,片段离子的质量容限为0.5道尔顿。然而,匹配小于5 ppm的质量准确度被认为是假阳性,并被丢弃。所有PeptideProphet概率大于0.9的鉴定都提交给ProteinProphet,随后的蛋白鉴定以1%的错误率过滤胰蛋白酶片段(2个缺失的裂解),并允许对其进行固定修饰gydF4y2BaCgydF4y2Ba= 57.021和变量修改gydF4y2BaCgydF4y2Ba= -17.027,gydF4y2BaEgydF4y2Ba= -18.011,gydF4y2BaKgydF4y2Ba= 6.020,gydF4y2Ba米gydF4y2Ba=15.995,以及gydF4y2Ba问gydF4y2Ba= -17.027。蛋白质通过每个蛋白质中存在2个或更多的肽来识别。gydF4y2Ba
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