本研究的目的是评估Terra PCR直接聚合酶混合物来自Takara Bio的研究,以确定是否可以使用两种常规热循环平台(Streck’s Philisa Rapid thermal Cycler和Biometra TGradient thermal Cycler)直接从男性全血中进行DNA扩增。PCR分析之前的DNA纯化是一个劳动和时间密集的过程。去除纯化步骤将有利于分子诊断实验室改善样品周转时间和加快时间关键的结果。
该研究结果表明,Terra PCR直接聚合酶混合物在所有测试的所有浓度(2.5-30%)上成功扩增了来自男性全血的Y-染色体性别测定区域(Sry)基因扩增子。使用制造商的建议获得数据,以最小的改变PCR协议。菲利斯快速热循环仪由于热循环仪之间的斜坡率差异而比Biometra热循环仪更快地完成了标准方案30分钟。
案例研究
直接从男性血液中扩增y染色体DNA
Terra直接PCR试剂盒和Philisa热循环仪提高了样品的周转时间
介绍
结果
从下图中可以看出,随着人类男性全血浓度的增加,SRY PCR产物在所有的样品中都被成功扩增,其中有代表性的148碱基对SRY PCR扩增产物。较小的凝胶带是引物二聚体,与扩增的SRY产物无关。无论全血浓度如何,凝胶上的条带强度在热循环器之间出现相似。SRY DNA的扩增在Philisa热循环仪上大约快了30分钟,可能是由于更快的斜坡速率。
![用Terra PCR直接聚合酶混合PCR扩增SRY基因](http://www.yamajr.com/learning-centers/pcr/technical-notes/images/500-PCR/CC-TechFigs/terra-pcr-direct-sry-amplicon-detection-6859-T.jpg)
通过使用越来越多的人类雄性全血,通过PCR与Terra PCR直接聚合酶混合来描绘Sry扩增子检测的琼脂糖凝胶。对于Biometra热循环仪(底部)的Philisa热循环仪(顶部)和85分钟的总扩增时间为55分钟。
结论
SRY基因片段从全血中直接插入PCR管中成功扩增Terra PCR直接聚合酶混合物被证明了。这表明通过使用人类全血为粗样基质,可以使用Terra PCR直接聚合酶混合物进行基因组DNA检测。
方法
在STRECK LABLATORIES中进行测试,通过TAKARA BIO提供的Terra PCR直接聚合酶混合物。
按照制造商的建议使用Terra Direct PCR Polymerase Mix,并进行以下修改:聚合酶的延长时间延长到总共60秒,而不是推荐的60秒/kb的DNA。对于样品量,以50µl反应体积为基础,以指示的%浓度(2.5-30%)加入血液(1.25-15µl)。样品在1.5%琼脂糖凝胶上显示,使用溴化乙啶0.5µg/ml工作浓度。
使用SRY引物组进行测试:
F:5'-cgcattcatcgtgtggtctcgcg-3'
R: 5“-CTGTGCCTCCTGGAAGAATGGCC-3”
15 ng人雄性基因组DNA(Promega)用作纯度的阳性模板对照(PTC)。通过添加分子生物学级,无核酸酶(USB Corporation)制备了模板控制(NTC)。使用SECRECK Philisa快速热循环仪和Philisa PCR管或Biometra TGRadient热循环仪进行分析人类的全血样品:98°C,120秒;其次是40个周期:98°C,10秒;60°C,15秒;68°C,60秒。与Philisa快速热循环仪扩增的总时间为55分钟。用Biometra热循环仪扩增的总时间为1小时25分钟。
相关产品
万博体育投注manbetx登录
美国/加拿大:+1.800.662.2566•亚太地区:+1.650.919.7300•欧洲:+33。(0)1.3904.6880•日本:+81。(0)77.565.6999
仅供研究使用。不用于诊断程序。©2021 Takara Bio Inc.保留所有权利。所有商标均为Takara Bio Inc.或其在美国和/或其他国家的关联公司或其各自所有者的财产。某些商标可能不会在所有司法管辖区注册。其他产品、知识产权和限制使用信息可在takarabio.com上获得。