设计引物
引物设计是决定PCR成功与否的最重要因素。以下是一些在PCR中设计和使用引物的指南。
如果你正在用我们的In-Fusion cloning产品进行无缝PCR克隆,这里有一些具体的引物设计技巧对于这个应用程序。
设计引物时需要考虑哪些参数?
引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素。引物设计有两个主要考虑因素:特异性和效率。
- 特异性是由错误启动事件的频率决定的。特异性差的引物往往产生不需要的扩增子。
- 效率被定义为引物扩增产品的能力,每循环增加两倍,达到理论最优。
下表提供了底漆设计的指导方针。
的指导方针 | |
长度 | 引物的最佳长度为24或25个碱基。然而,如果熔化温度(T米)需要调整。当扩增长DNA片段(≥10 kb)时,25 ~ 35个引物可能提供更好的结果。 |
GC含量 | GC含量(引物中Gs和Cs的数量占总碱基的比例)应在40-60%。 |
3 '末端 | 如果引物长度较短,在3'端有四个G和/或C碱基可能是有用的(碱基提供“钳位效应”),特别是对于通用引物,这通常用于扩增样品中的所有cDNA或gDNA。然而,添加这些碱基可能增加基因特异性引物的非特异性引物事件。 |
T米 | 如果可能,设计的底漆的熔化温度为68-70°C。虽然这不是绝对必要的,但使用严格的PCR条件(如“触地PCR”和“两步PCR”)可以提高引物的特异性。 |
序列特异性 | 引物应该针对你感兴趣的基因。一个爆炸的搜索可以用来找到同源区域。注意:PCR的产量通常取决于PCR引物的3'六聚体。形成强稳定双链的引物实际上降低了扩增效率。 |
避免 | |
重复 | 引物中最大的双核苷酸重复数为4个(如atatat)。 |
运行 | 避免一个碱基长时间运行(超过三个),因为这可能导致引物滑移和导致引物错误。 |
补充3 '端 | 正向和反向引物不应相互退火,因此不应有互补的G或C延伸(>4个连续的碱基)。 |
自补3 '端 | 自互补(例如,在前引物内)可以导致发夹形成。发夹结构可以由茎部的4个G/C碱基对和环部的3个碱基对构成。 |
我怎么计算熔化温度(T米)的引物吗?
底漆熔化温度(T米)是DNA-DNA杂交稳定性的估计。了解T米是确定适当退火温度(T一个).一个T一个过高会导致引物模板杂交不足,导致PCR产物产量低。一个T一个过低可能导致非特异性产品扩增。
T的计算米对于小于20个碱基的引物,可采用华莱士规则进行:
T米= 2°c (a + t) + 4°c (g + c)
为了准确估计T米对于超过20个碱基的引物,我们建议使用免费的引物设计软件,如Primer3.
PCR的引物浓度应该是多少?
每个引物的最终浓度应在0.1 ~ 0.5µM之间。每个引物的固定溶液通常为10-20µM。
- 对于小于10 kb的PCR扩增产物,0.2µM的扩增结果令人满意。
- 用于长靶(~17 kb)的扩增豆类LA TaqDNA聚合酶或豆类Taq交货DNA聚合酶,引物浓度可增至1µM。
- 高产量聚合酶的推荐引物浓度,如优势2:DNA聚合酶和钛TaqDNA聚合酶0.4µM。
引物浓度过高会增加错误引物的机会,导致非特异性扩增。限制性引物浓度可导致极低的扩增效率。
如何为PCR纯化寡聚物?
标准脱盐引物适用于大多数PCR应用。
使用含肌苷的引物时应采取哪些预防措施?
豆类TaqDNA聚合酶和豆类TaqDNA聚合酶热启动版本与含肌苷的引物兼容。
含肌苷的引物不应与具有3'→5'外切酶活性的PCR酶一起使用(例如,PrimeSTAR HS DNA聚合酶、PrimeSTAR Max DNA聚合酶、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、豆类的前女友TaqDNA聚合酶,简称TakaraLA Taq也不与Terra PCR直接聚合酶。当使用其中一个兼容的TakaraTaq对于简并PCR酶,我们建议使用简并引物与a, T, G,或C在期望的位置(s)的混合,而不是包含肌苷的引物。
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