使用特定的应用和条件
通用PCR应用信息
什么因素对多重PCR至关重要?
多重PCR中使用的所有引物对应具有相似的靶向效率的靶DNA。这可以通过使用具有几乎相同的最佳退火温度的引物来实现。
在设计底漆时,要特别注意以下参数:
- 与目标核酸序列的同源性
- 长度
- GC内容
- 浓度
- 引物同源性(引物内部或彼此之间不应有同源性,尤其是在3'端)
什么是嵌套的PCR?
嵌套的PCR是一种涉及重新扩增以改善PCR结果的方法。嵌套的PCR涉及设计新的前向嵌套(FN)或反向嵌套(RN)底漆,该嵌套(FN)底漆是原始底漆内部的,并且可以与原始伙伴底漆配对。将非常少量的主要PCR产物用作具有嵌套引物的PCR的模板。
嵌套的PCR经常导致所需PCR产品的产量:
- 消除初始PCR中可能存在的额外条带
- 在初始PCR中产生可能弱或不可见的强大带
值得注意的是,巢式PCR中只能使用非常少量的初级产物,因为该模板的序列复杂度非常低。首先,初级PCR产物可以稀释1:100,1µl可以用作巢式PCR的模板。此外,您可能需要将循环数减少到25–30。巢式PCR的最佳条件应根据经验确定。
什么是着陆PCR(TD-PCR)以及何时需要使用它?
在PCR变性步骤期间,所有DNA分子将变为单链。当对退火的温度降低时,可以形成三种类型的双工:
- 互补股的同源性 - 退火
- 异水分布 - 同源序列的交叉杂交,其可能具有部分同源性
- 引物和模板之间的双工
为了获得更高的特异性,应通过在初始PCR循环期间增加严格性(即,增加温度)来最小化异源双链的形成。接地PCR通过使用逐渐降低退火温度的反应条件来提高特异性。初始退火温度设置为高于估计温度几度m引物的选择。在随后的循环中,退火温度缓慢降低,直到达到底漆的计算退火温度(Don 1991)。通过在初始PCR循环中使用较高的退火温度,触地PCR有利于积累引物-模板互补性最高的序列的扩增子,从而富集最特异的扩增子。在随后的循环中转换到较低的温度会降低严格性,从而改善已富集的所需模板的启动条件。我们建议在较高的退火温度下进行初始5–10个循环,然后逐渐降低温度,直到达到最佳退火温度或“接地温度”。例如,如果m底漆是68°C,推荐的TD-PCR条件用于退火温度:
- 72°C的5个循环,然后
- 在70°C下5周期,然后
- >在68°C下进行25次循环
参考
唐,R.H。,等等。“触地”PCR可避免基因扩增过程中的假启动。诊断酸Res。19(14):4008(1991)。
如何将钝端PCR产物克隆到TA克隆载体中?
如果使用产生钝端的高保真聚合酶扩增PCR产物,则可以使用延尾使用Taq.聚合酶。下面提供了向PCR产物中添加3'A-悬垂物的简要方案。
- 纯化PCR产物。在添加悬垂物之前,使用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化或通过苯酚提取和DNA沉淀,去除反应中所有的聚合酶是非常重要的。这一步是至关重要的,因为任何残留的DNA聚合酶的校对活性都会降解A悬垂物,从而重建钝端。
- 准备Taq.DNA聚合酶反应混合物:
最终浓度 | 体积(微升) | |
纯化的PCR产品 | 0.15–1.5 pmol | 变化* |
dATP(10毫米) | 0.2毫米 | 1 |
PCR缓冲液用mg2+(10倍) | 1x(1.5 mm mgcl2) | 5. |
Taq.DNA聚合酶(5 U/微升) | 1 U. | 0.2 |
DDH.2O. | 至50微升 |
*当使用特定数量的PCR产物时,a -加成反应效果最好。建议用量为每100 bp PCR产物10-100 ng。这相当于0.15-1.5 pmol的PCR产物(见下表)。
PCR产品尺寸 | 使用PCR产物的数量 |
100个基点 | 10-100纳克 |
250 bp | 25-250纳克 |
1,000 bp. | 100-1000纳克 |
3.在72℃下培养20分钟。
继续克隆。为了最佳结扎效率,最好使用新的PCR产品,因为在储存期间3'A悬垂会逐渐丢失。
哪种聚合酶产生钝的末端与悬垂性末端?
- PrimeSTAR系列中的酶
这些酶表现出大量的3′→5'核酸外切酶活性,主要产生末端钝的扩增产物。因此,我们建议使用强大的克隆试剂套装(钝端)用于钝端克隆。 - Taq.和Terra酶
塔卡拉Taq.,Takara.前任Taq.,Takara.塔克酒店, SpeedSTAR HS, EmeraldAmp, SapphireAmp Fast和Terra PCR DNA聚合酶主要产生的扩增产物含有3'-dA悬悬物,可以直接用于ta克隆。钝端克隆也可以使用强大的克隆试剂套装(钝端)。 - 所有Takara生物DNA聚合酶
用特定聚合酶扩增后的片段末端结构在下表中表明。一些聚合酶产生钝端和悬垂产品的混合物;其他聚合酶仅产生钝端或悬垂的产品。
聚合酶 | A形悬挑 | 钝端 |
塔卡拉Taq.DNA聚合酶 |
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塔卡拉前任Taq.DNA聚合酶 |
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塔卡拉塔克酒店DNA聚合酶 |
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钛Taq.DNA聚合酶 |
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优点2聚合酶混合 |
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优势GC 2聚合酶混合物 |
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优点HF 2聚合酶混合物 |
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EmeralDamp GT PCR主混合物 |
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EmeralDamp Max HS PCR主混合物 |
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SapphireAmp快速PCR主混合物 |
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高产PCR生态干燥预混料 |
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高保真PCR生态干燥预混料 |
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Terra PCR直接聚合酶混合物 |
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SpeedSTAR HS DNA聚合酶 |
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PrimeSTAR HS DNA聚合酶 |
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PrimeSTAR GXL DNA聚合酶 |
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樱草颗MAX DNA聚合酶 |
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CLONEAMP HIFI PCR预混件 |
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Seqamp DNA聚合酶 |
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Takara Z-Taq.DNA聚合酶 |
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E.2TAK DNA聚合酶 |
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完美的前任Taq.DNA聚合酶 |
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通过聚合酶保真度是什么意思?什么应用需要高保真聚合酶?
DNA聚合酶的保真度是指其精确复制模板的能力,或者在引物的3'末端添加正确的核苷酸。基础MISCLONTORATION的速率被称为错误率。具有校对活性的PCR聚合酶具有3'→5'外切核酸酶活性,可以促使掺入错误的核苷酸并用正确的核苷酸替换它们。
高保真聚合酶被推荐用于基因克隆、蛋白质表达、蛋白质结构功能研究、cDNA文库构建和下一代测序。要选择高保真聚合酶,请参阅PCR选择指南。
我如何比较不同高保真聚合酶的错误率?
供应商报告的聚合酶错误率不能总是直接比较,因为使用不同的方法来测量保真度。这些方法包括:
- 蓝白屏蔽
这种方法基于表型变化,由于其快速、相对简单和成本效益高而被广泛使用。最初的蓝白筛查方法,称为Kunkel方法(Kunkel和Tindall 1987),是基于lacZα这种基因可以恢复β-半乳糖苷酶的活性,并允许产生蓝色。用这种方法,菌落从lacZα含有单核苷酸错误或移码突变的PCR产物通常为白色,而来自无错误扩增子的克隆产生蓝色菌落。 - 测序方法
这种方法利用PCR后单个菌落的桑克序列。蓝白筛选方法可以快速测量聚合酶保真度,但它与测序方法不如精确。蓝白方法不会检测不影响翻译的单核苷酸突变,单核苷酸取代。测序方法可以检测所有突变,因此更准确。
参考
Kunkel,T.A.和Tindall,K.R.,《DNA合成的保真度》水热DNA聚合酶。生物化学27日,6008-6013(1987)。
基因MAX和PREMESTAR GXL DNA聚合酶具有非常高的保真度;如何测量这些酶的富达?
通过PCR后的单个菌落测序,测量基马乙胺酰基聚合酶的保险费,如下所述:
- 十个任意选择GC的地区嗜热菌扩增HB8基因组DNA。
- PCR产物被克隆到质粒载体中。
- 为每个相应的扩增产物选择多个克隆,并测序PCR插入物。
樱草颗MAX DNA聚合酶有富达29倍Taq.聚合酶,而PrimeSTAR GXL DNA聚合酶有保真度6.5xTaq.聚合酶。
使用含Inosine的引物时应采取哪些预防措施?
豆类Taq.DNA聚合酶和豆类Taq.DNA聚合酶热启动版与含伊斯坦的引物相容。
不应与具有3'→5'外切核酸酶活性的PCR酶的含氨基的引物(例如,PrimeStar HS DNA聚合酶,矢车柱GX1 DNA聚合酶,TaKaRa ExTaq.DNA聚合酶或Takara塔克酒店DNA聚合酶),也没有Terra PCR直接聚合酶。当使用其中一个兼容的Takara时Taq.用于简并PCR的PCR酶,我们建议使用以所需位置而不是含InoSine的引物的脱脂引物的混合物。
特定应用的聚合酶
最高保真度
番石醇聚合酶提供更好的保真度PfuDNA聚合酶被广泛认为是高保真酶。樱草颗MAX DNA聚合酶有最高的忠诚;用该酶扩增整个pUC119质粒时,序列分析在全部测序的370,656个碱基中仅检测到4个突变(错误率为0.0010%)。此外,与其他酶相比,PrimeSTAR Max DNA聚合酶复制重复序列的保真度明显更高,与类似序列的模板交换(嵌合分子形成)率更低。
富含GC的目标序列
考虑以下酶:
- 第一选择:PrimeSTAR GXL DNA聚合酶是最有效的气相色谱丰富的模板,如细菌基因组DNA。它有利于高保真放大,误差很小。PrimeSTAR GXL DNA聚合酶在标准反应中使用该酶提供的缓冲液成功扩增了GC含量~70%的区域。
- 第二选择:优势GC 2聚合酶混合物建议用于复杂模板,包含高达90%的GC含量。该聚合酶适用于高达6kb的碎片。优点GC 2与DMSO和GC-MELT试剂一起使用的聚合酶允许扩增几乎所有富含GC的序列。
- 第三种选择:对于具有刚性结构的GC富含GC的靶标,并且难以用基氏菌GXL DNA聚合酶扩增,使用Takara la Taq.具有GC缓冲液的DNA聚合酶。首先尝试GC缓冲区;该缓冲器有助于扩增长产品。GC缓冲器II对于具有复杂高阶结构的模板是有效的,尽管该缓冲液对较短产品的放大更有效。
远程PCR
PrimeSTAR GXL DNA聚合酶当长度(>6 kb)和保真度都是因素时,建议使用。人类基因组DNA模板的30kb产物的扩增已经用这种酶完成。塔卡拉塔克酒店DNA聚合酶也可用于远程PCR;当长度和稳健的放大是优先级时,建议使用该酶。
快速PCR
我们有几种可用于快速反应的PCR酶。
- 速度和逼真度-樱草颗MAX DNA聚合酶含有专有的伸长因子,并且具有出色的初步效率,允许短至5秒/ kB的延伸时间,并且仅为5秒的退火时间。推荐该酶用于克隆和表达研究。
- 高通量应用与快速菌落PCR-SapphireAmp快速PCR主混合物是高吞吐量项目的经济选择。该2x酶预混物包括高速聚合酶,优化缓冲液,DNTP混合物,凝胶加载染料(蓝色)和密度试剂。由于它需要只有10秒/ kB的延伸时间,因此菌落PCR反应可以在<1小时内完成,以便粘合剂最多1 kB。
- SNP基因分型和快速远程PCR-SpeedSTAR HS DNA聚合酶高效且能可靠地进行PCR扩增,扩增时间在10到20秒/kb之间。
富含靶分序列
TaKaRa ExTaq.DNA聚合酶和PrimeSTAR GXL DNA聚合酶对扩增丰富的靶序列有效,如含有内含子的基因组DNA或丰富的线粒体DNA。我们推荐PrimeSTAR GXL DNA聚合酶在高精度的丰富模板上进行扩增。与其他PCR酶相比,PrimeSTAR GXL聚合酶可以使用标准PCR协议和提供的反应缓冲液扩增AT含量>60%的目标。
注意:PrimeSTAR GXL DNA聚合酶不能用于扩增亚硫酸氢盐处理的DNA或其他含尿嘧啶的模板。对于此应用程序,请尝试TaKaRa EpiTaq HS(用于亚硫酸氢盐处理的DNA)。
亚硫酸氢盐处理的DNA
有几种选择:
- TaKaRa EpiTaq HS(用于亚硫酸氢盐处理的DNA)使用亚硫酸氢盐处理的含有尿嘧啶的DNA模板优化PCR扩增。该酶包括热启动抗体,设计用于甲基化分析,包括COBRA和亚硫酸氢盐测序分析。
- 这会阴镜MSP套件专为甲基化特异性PCR(MSP)测定而设计。
- 豆类Taq.DNA聚合酶和豆类Taq.DNA聚合酶热启动版,缺乏3'→5'外切核酸酶活性的两种情况都可以在某些情况下使用。
PCR抑制剂
TaKaRa ExTaq.DNA聚合酶即使在来自植物组织的粗DNA提取物中发现的PCR抑制剂,诸如多酚的PCR抑制剂,也是非常稳健的。PrimeSTAR GXL DNA聚合酶建议在需要高保真时。虽然基氨基GX1聚合酶通常产生令人满意的结果,但如果存在非常高浓度的抑制剂,酶浓度可以提高酶浓度。
另外,Terra PCR直接聚合酶混合物允许从可能含有高水平PCR抑制剂的粗样品中直接扩增。Terra PCR直接聚合酶可有效扩增多种靶点,包括GC-和AT-丰富靶点。这种酶也可用于血液样本的直接PCR。
在不能用这些酶产生扩增产物的情况下,可能需要纯化模板DNA。
石蜡/ FFPE部分
这Terra PCR直接FFPE试剂盒可用于粗DNA制备和石蜡包埋组织切片的直接PCR扩增。
如果有必要先从石蜡包埋的组织中提取DNA,TaKaRa DEXPAT轻松和TaKaRa-DEXPAT试剂实现快速、高效的DNA制备,即使是从保存多年的载玻片或样本中。
PCR后的凝胶电泳(例如,基因分型筛选)
我们推荐EmeralDamp GT PCR主混合物。该PCR主混合物含有绿色凝胶加载染料和密度试剂,使得可以易于制备PCR反应混合物,其可以在PCR后直接装载在琼脂糖凝胶上的琼脂糖凝胶上。Emeraldamp GT PCR主混合物可以扩增高达10kb的靶长,包括GC-或富含GC-或富含的靶标。另外,用eMeraldamp GT PCR主混合物产生的PCR产物可直接用于限制酶消化,测序或无纯化的克隆。
菌落PCR
我们推荐SapphireAmp快速PCR主混合物用于菌落PCR。这种酶预混料可以耐受大量细菌核酸的存在。跟踪染料和密度试剂包含在主混合物中,允许PCR反应产物直接装载在琼脂糖凝胶上进行电泳。
最高的敏感性
对于最高灵敏度,我们建议钛Taq.DNA聚合酶或者TaKaRa ExTaq.DNA聚合酶. 这两种聚合酶已成功用于高灵敏度基因分型应用。
从组织直接扩增
我们推荐Terra PCR直接聚合酶混合物用于扩增来自粗提取物或直接来自组织的靶。下面列出了应该用于直接PCR的各种组织的推荐量:
- 治疗血液:≤5μL
- 鼠标尾部:≤1mm
- 鼠标耳:≤1.5毫米2
- 植株叶片:≤1.2 mm(直径)
- 石蜡嵌入式组织部分:≤1-1.5厘米2
多重PCR
我们推荐豆类Taq.DNA聚合酶或者钛Taq.DNA聚合酶多重PCR。查看我们的技术说明查阅有关使用Titanium的更多信息Taq.用于高通量基因分型的多重PCR中的DNA聚合酶。
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