图书馆的特点
PicoPLEX Gold使用多轮模板重新引物来产生微克的扩增DNA。单细胞扩增的成功率为100%,将失败率降至最低。从图2中可以看出扩增的一致性,其中5个细胞和单个细胞的三次扩增曲线分别用紫色和蓝色表示。无模板对照(NTC)的缺乏扩增表明试剂的纯度和化学反应的敏感性很高。
图2。 使用PicoPLEX金试剂盒实时分析库扩增。 相对于NTC(灰色),PicoPLEX Gold试剂盒制备的库的典型实时扩增分析使用单个(蓝色)和五个(紫色)GM12878细胞的三倍体。结果采用CFX96 Touch Real-Time PCR检测系统,以evgreen和荧光素为染料。
对第一代PicoPLEX技术的改进
并排评价了两代PicoPLEX产品的性能。使用PicoPLEX Gold Kit或PicoPLEX WGA Kit (PicoPLEX WGA)从15 pg的gDNA (NA12878)中制备文库,并在Illumina®NextSeq®平台上测序,深度约为3500万读对(PE 2 x 150 bp)。如表1所示,与PicoPLEX WGA(33%)相比,PicoPLEX Gold(50%)的基因组覆盖率有所提高。此外,与PicoPLEX WGA数据(21%)相比,PicoPLEX Gold数据的重复率显著降低(9%)。PicoPLEX Gold试剂盒中高保真聚合酶的使用将等位基因的drop-in降低到最低水平,使得SNV检测具有更高的可信度(图4D,下面)。
PicoPLEX WGA试剂盒
PicoPLEX金单细胞dna测序试剂盒
基因组覆盖率(> 1 x)
~33%
~ 50%
重复率
~21%
~9%
忠诚
高
非常高的
再现性
非常高的
非常高的
工作流
单管,3步2.5小时工作流程。需要Nextera®库准备。
4-步骤3 hr工作流程。直接挥动图书馆。
表1 .与第一代PicoPLEX WGA试剂盒相比,PicoPLEX Gold的改进。 用15 pg的(NA12878) gDNA制备文库,测序深度为3500万对(pe2 × 150 bp)。PicoPLEX Gold具有更好的覆盖范围,较低的重复率,较高的保真度,以及同类中最好的样品对样品的重现性。
基因组覆盖率、一致性和再现性
对比QIAseq FX多重位移放大(MDA)技术,我们测量了PicoPLEX Gold的覆盖深度、均匀性和重现性。PicoPLEX Gold在较低深度的覆盖率与QIAseq FX (MDA)相似,在较高深度的覆盖率更大(图3A)。值得注意的是,PicoPLEX Gold具有高度均匀的覆盖模式,比QIAseq FX的覆盖模式要好得多(图3B)。PicoPLEX Gold的两个单细胞间覆盖的重现性明显更高,这为结构变异的检测提供了明显的优势(图3C)。
图3。PicoPLEX Gold的主要特点:覆盖全面,均匀性高,重现性好(与QIAseq FX相比)。面板。 显示不同测序深度(约35M读取对,PE 2 x 150 bp)所覆盖碱基数量的对数图。PicoPLEX黄金的覆盖率在较低深度与QIAseq FX(MDA)相似,在较高深度则更大。面板B。 gDNA(NA12878)和75 kb窗口(chr2)的单细胞样本(GM12878)中PicoPLEX Gold和QIAseq FX的覆盖模式示例。MDA更倾向于在基因组中留下较大的缺口,而PicoPLEX Gold的覆盖范围更为均匀。小组C。 通过比较100 kb箱子中的总读值来评估覆盖的重现性。与QIAseq FX(右)和市场上其他技术(未显示数据)相比,PicoPLEX Gold(左)每个窗口中从两个单细胞库中读取的总读数的一致性明显更高。
提高了SNV检测的回收率和准确性
单细胞WGA的两个关键伪基因是等位基因退出(ADO;假阴性)和等位基因drop-in (ADI;假阳性)。除了SNVs的高回收率外,PicoPLEX黄金 在ADO和ADI速率方面都具有优异的性能。我们使用GM12878单细胞和5个细胞对PicoPLEX Gold的性能进行了评估,测序深度约为3500万个读取对(PE 2 x 150 bp;重复数据消除),并使用瓶数据集中的NIST基因组对错误率进行基准测试。SNV使用标准GATK管道生成,并严格过滤(最小深度为10倍,GATK质量分数为75或更高)。与QIAseq FX(MDA)相比,PicoPLEX Gold检测到的单细胞SNV总数高3.5倍,五细胞SNV总数高9倍(图4A)。等位基因平衡的改善(图4B)导致等位基因退出显著减少,与QIAseq FX(MDA)相比,下降了5倍(图4C)。PicoPLEX Gold中使用的高保真聚合酶可显著降低假阳性率(图4D)。
图4。用PicoPLEX Gold检测高质量单核苷酸变异(SNV)。A小组。 比较QIAseq FX (MDA)、PicoPLEX Gold (PP Gold)和PicoPLEX WGA (PP WGA)试剂盒在1个细胞(1c)、5个细胞(5c)或15 pg NA12878 gDNA输入下的snv检出率。单个细胞和5个细胞测序至~35M读对深度,gDNA样本测序至~40M读对深度。与QIAseq FX(灰色条)和PicoPLEX WGA(紫色条)相比,PicoPLEX Gold(蓝色条)的高保真度和鲁棒覆盖率在检测更多(~ 2-9倍)高质量snv方面具有明显的优势。面板B。 PicoPLEX Gold(蓝色条)的B等位基因频率的对称分布集中在0.5左右,表明两个等位基因的平衡恢复。与QIAseq FX(MDA)(灰色条)相比,PicoPLEX具有更好的等位基因平衡。小组C。 在所有单细胞文库制备技术中,PicoPLEX Gold的无偏放大导致最低的等位基因退出率(假阴性)。D小组。 PicoPLEX Gold试剂盒中使用的聚合酶的高保真度(蓝色条)导致最小的等位基因下降率,与QIAseq FX(灰色条)相当,显著低于PicoPLEX WGA(紫色条)。
低通测序从单个细胞中检测CNV
PicoPLEX技术已成为检测单细胞非整倍体的金标准,这主要是由于其无与伦比的样品间重复性。PicoPLEX Gold利用传统产品的优势,通过提高CNV检测的分辨率,实现小结构变体的识别。使用两个已知具有不同大小的稳定非整倍体的NCI-H929细胞证明了PicoPLEX Gold的优越CNV检测。我们评估了试剂盒在不同测序深度一致检测CNV的能力,与在更高深度测序的批量样品相比。绘制了NCI-H929细胞(样本)和GM12878细胞(整倍体参考)在50 kb存储箱中读取的总次数的Log2比率(图5)。PicoplexGold在不同的读取深度检测到相同的小非整倍体(大小为100-500KB):1750万、850万甚至250万读取对。在两个生物复制品(图5A和5B)中对这些结构变体的一致检测表明样品间的高度再现性。
图5。使用PicoPLEX金单细胞DNA-seq试剂盒在两个独立细胞中检测到cnv。 日志2. 单个NCI-H929细胞的50 kb bins中reads总数的比率,如图A组中的一个细胞和b组中的第二个细胞所示。红色条代表复制数增加,而蓝色条代表损失。每个面板中图形的顶部一行描述了按9000万读对深度排序的控件批量样本。PicoPLEX Gold试剂盒的高重复性覆盖范围能够精确检测结构变异,小到100 kb,甚至在浅测序深度(250 - 850万读对)。