B细胞是适应性免疫反应的重要组成部分,在其表面表达B细胞受体(BCRs),从而能够识别病原体中的独特分子模式。了解BCRs的概况(即受体和克隆型的多样性)不仅有助于了解健康个体的适应性免疫反应,也有助于了解患有广泛疾病的人的适应性免疫反应。准确测定免疫系统表达的克隆型和同型将有助于对b细胞库的完整了解。
当前的下一代测序(NGS)方法分析b细胞序列,为适应性免疫反应和抗体工程提供了有价值的见解。有两种主要的方法用于分析b细胞库:多重PCR和5' RACE结合NGS。虽然多路复用允许你在一个反应中扩增多个BCR基因,但它可能在某些序列扩增的敏感性、特异性和偏差方面具有挑战性,所有这些都可能导致精确和可重复的同型鉴定困难。
新更智能的人BCR IgG IgM H/K/L分析试剂盒利用SMART技术(年代有魅力的米助力一个t 5'结束RNAT安置)并将NGS与5'种族方法配对,以提供敏感、准确和优化的BCR分析方法(图1A)。与使用多重PCR的系统相反,5'-RACE方法不需要任何包含BCR转录本5'端序列的先验知识。5'-RACE方法降低了变异性,并允许从IgG和IgM重链或轻链的恒定区域开始启动(图1B)。5’RACE与基因特异性扩增的优势结合在这一高度敏感和可重复的B细胞谱分析方法中,并允许您捕获BCR转录本的完整V(D)J可变区。下游测序允许在大多数情况下准确识别顶端克隆型和可靠分配同型。
这种新的图谱试剂盒还包括独特的分子识别器(UMI)。BCR UMI Oligo包含12个随机核苷酸,这些核苷酸在模板转换步骤中被合并到cDNA中。与our连用Takara生物免疫分析器软件,可以检测和去除PCR重复和错误,更准确可靠的克隆型调用和定量。
图1所示。SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit工作流程。面板。第一链cDNA的合成是dt引物,由mmlv衍生的SMARTScribe逆转录酶(RT)进行,该酶在到达每个mRNA模板的5'端时添加非模板核苷酸。SMART UMI Oligo对这些非模板核苷酸进行退火,并作为模板,通过RT将额外的核苷酸序列合并到cDNA第一链中(这是模板转换步骤)。然后对第一个cDNA链进行两轮基因特异性PCR扩增(详情见图B)。第二轮嵌套式PCR确保了绝大多数reads映射到B细胞受体转录本。面板B。第一个PCR使用第一链cDNA作为模板,包括正向引物序列互补的Illumina公司读底漆2(向前PCR1通用底漆),和反向引物互补的恒定区BCR重或轻链(PCR1 IgG、IgM / IgK IgL反向引物)。第一个PCR以Read Primer 2序列和恒定区为引物,特异性扩增出BCR重链或轻链cDNA的整个可变区和相当一部分恒定区。第二次PCR以第一次PCR的产物为模板,采用半嵌套引物(PCR2 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse引物)扩增BCR重链或轻链cDNA的整个可变区和部分恒定区。