染色质提取和剪切
大约有250非洲爪蟾蜍原肠胚用1%福尔马林固定,-80℃保存至加工。用裂解缓冲液裂解固定原肠胚,浓缩细胞核,用Picorupter sonication device (Diagenode)裂解染色质。一小部分染色质碎片被保存为输入样本。
染色质免疫沉淀和DNA纯化
将抗otx2抗体偶联到Protein A磁珠上,将抗体结合的磁珠加入到破碎的染色质中,将混合物在4°C旋转孵育过夜。然后用RIPA缓冲液洗涤一次,并在含1% SDS的洗脱缓冲液中在65°C孵育过夜。经过RNase A处理和蛋白酶K脱交联后,用MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化DNA,两次洗脱,每次10µl。使用dsDNA HS试剂盒(Qubit)对回收的DNA进行量化。
库的准备和排序
用ThruPLEX DNA-seq试剂盒制备DNA-seq文库,使用10µl的Otx2 ChIP或Input DNA。ThruPLEX文库在Illumina NextSeq 550上以75 bp的配对读取进行测序。
数据分析
测序reads被映射到非洲爪蟾蜍基因组(v9)使用Burrows-Wheeler比对仪,基因组区域使用整合基因组查看器(Broad Institute)可视化。