的Adeno-X qPCR滴定试剂盒提供了一种极其快速、简单和准确的方法来滴定所有以ad5为基础的腺病毒载体中的腺病毒库存。该试剂盒仅在4小时内提供结果,这是对标准滴定方法(如空斑检测)的巨大改进,后者需要10天才能完成。由于qPCR滴定非常快,靶细胞可以在收获病毒的同一天被精确滴定的病毒感染。
图1所示。用Adeno-X qPCR滴定试剂盒滴定腺病毒DNA的程序流程图。
定量PCR腺病毒滴定法
的Adeno-X qPCR滴定试剂盒提供了一种极其快速、简单和准确的方法来滴定所有以ad5为基础的腺病毒载体中的腺病毒库存。该试剂盒仅在4小时内提供结果,这是对标准滴定方法(如空斑检测)的巨大改进,后者需要10天才能完成。由于qPCR滴定非常快,靶细胞可以在收获病毒的同一天被精确滴定的病毒感染。
图1所示。用Adeno-X qPCR滴定试剂盒滴定腺病毒DNA的程序流程图。
该方案将qPCR与TB绿色化学相结合,允许您从校准的DNA标准曲线(图2)确定腺病毒制剂(即粗裂解物或纯化储备)中的病毒基因组拷贝数。程序很简单:病毒DNA和对照DNA(提供)被连续稀释并进行qPCR。然后,通过将每个病毒样本的Ct值与稀释对照样本的Ct值与其各自的拷贝数绘制的标准曲线进行比较,确定每个病毒样本的DNA拷贝数(图2)。图3显示了当与粗裂解物或纯化病毒一起使用时,证明该方法一致性的滴定分析。
图2。Adeno-X qPCR滴定法动态范围广。腺嘌呤- x DNA对照模板连续稀释至108-10年3.用Adeno-X qPCR滴定试剂盒分析。放大图(板一个)显示至少六个数量级的动态范围(每一稀释度用不同颜色的图表示)。标准曲线(面板B)显示Ct和DNA拷贝数(对数标度)之间有很强的线性相关性,R2= 1.000, PCR效率为96.2%。
图3。从粗裂解物或纯化的病毒颗粒中滴定腺病毒。用Adeno-X qPCR滴定试剂盒滴定从两种粗裂解液(板一个)及纯化病毒颗粒(面板B).在这两种情况下,用病毒纯化试剂盒(附Adeno-X qPCR滴定试剂盒)获得无衣壳DNA,并在qPCR前连续稀释(10倍)(每一稀释度用不同颜色的图表示)。无论病毒颗粒的纯度如何,滴定过程都同样有效。
一旦确定了病毒库存的基因组拷贝数,它就可以与病毒感染单位的数量(IFU;以建立拷贝数/IFU关系(表I)。确定给定准备剂的拷贝数/IFU关系可以使每个实验中使用的准备剂数量归一化,以获得一致的分析间结果。
表一:Adeno-X qPCR滴定与其他滴定方法的比较 | ||||||
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滴定法 | Adeno-X qPCR滴定比率 | |||||
样本类型 | 病毒 | qPCR一个(拷贝/毫升) | 萤石b(IFU /毫升) | 半乳糖苷(IFU /毫升) | qPCR/Fluor(副本/IFU) | qPCR/X-Gal(副本/IFU) |
纯化 | AdAcGFP1 | 5.62×109 | 3.03×109 | N/A | 2 | N/A |
原油 | AdAcGFP1 | |||||
准备一个 | 1.44 × 1010 | 1.90×109 | N/A | 8 | N/A | |
准备B | 1.46×1010 | 2.26 × 109 | N/A | 6 | N/A | |
预科C | 1.38×1010 | 2.73×109 | N/A | 5 | N/A | |
纯化 | 阿德拉茨 | 1.01×1010 | N/A | 1.54×109 | N/A | 7 |
原油 | 阿德拉茨 | |||||
准备一个 | 1.33×1010 | N/A | 2.67×109 | N/A | 5 | |
准备B | 1.24×1010 | N/A | 2.67×109 | N/A | 5 | |
预科C | 1.21×1010 | N/A | 3.15 × 109 | N/A | 4 |
我们的方法使得在已知的多重感染(MOI)感染细胞成为可能,允许您产生精确、一致和可解释的结果。的Adeno-X qPCR滴定试剂盒包括足够200个qPCR反应的材料,并允许同时滴定多种病毒制剂。
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