腺相关病毒分离、纯化和滴定的精简工作流
腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)是一种非包膜单链DNA病毒,可感染非分裂和分裂细胞。AAV被认为对人类无致病性,只在有辅助病毒存在的情况下复制。这些特点使AAV成为一个有用的工具,基因传递到各种类型的细胞和有吸引力的载体的基因治疗。
重组AAV载体的特点:
- 易于高滴度生产(无辅助系统)
- 重组AAV不整合到宿主基因组中
- 可以用来转导增殖和非增殖细胞吗
- 能在非分裂细胞中给予长期表达吗
- 不要引起显着的免疫反应在活的有机体内
AAV工作流程
AAVpro工作流程概述
AAVpro系列是一套产品,通过纯化和滴定,从制备和提取中生成高滴度的可转导的重组AAV粒子。使用AAVpro系统获得的AAV2颗粒可用于哺乳动物细胞或单个动物的转导(在活的有机体内转导)。
图1所示。AAV粒子生产流程。
没有辅助病毒的高滴度AAV准备
这个AAVpro无助手系统(AAV2)是一种独特的系统,用于制备高滴度AAV2颗粒,无需使用辅助病毒。
- 用编码产生重组AAV颗粒所需所有因子的三种质粒共转染HEK 293T细胞。
- 在该系统中在人microRNA-342的非常高滴度表达中产生AAV颗粒增加(图2)。
图2。人miRNA-342表达对AAV2滴度的影响。AAV2颗粒从产生病毒的hek293t细胞中提取。采用实时荧光定量PCR(总载体基因组;vg)。与不表达microRNA的细胞相比,在该系统中表达miR-342导致滴度增加两倍。
简单高效的AAV粒子提取
从产生AAV粒子的细胞中分离AAV粒子通常采用冻融或超声方法。然而,这些方法是耗时和/或需要特殊的设备。这个AAVpro提取解决方案为AAV粒子产生细胞分离AAV粒子提供了一种简单有效的方法。
- 与传统冻融方法相比,病毒颗粒回收率至少增加了3倍(图3)。
- 由此产生的病毒颗粒溶液含有少量的宿主DNA和蛋白质污染。
- 提取的AAV颗粒可用于细胞感染或进一步纯化*
*为了在活的有机体内使用AAVpro净化试剂盒.
图3。AAV粒子提取。用AAVpro提取液(A)或冻融法(B)从产生病毒的细胞中提取AAV2颗粒。通过定量PCR评估提取的AAV载体prep的滴度。
无超离心AAV颗粒纯化
AAV颗粒的纯度对于实现向单个动物和培养细胞的高转导效率非常重要。超速离心法通常用于纯化AAV颗粒,但这种方法耗时,需要仔细的技术才能获得高产量。这个AAVPRO净化套件(所有血清型)允许从产生病毒的细胞中简单快速(约4小时)纯化AAV颗粒。
- 得到纯化的AAV适合在活的有机体内研究。
- 易于沉淀和过滤方案可以从任何血清型纯化AAV颗粒(图3)。
- 观看视频协议»
使用AAVpro纯化试剂盒Maxi(所有血清型)收集的病毒颗粒纯度。通过在五个T225烧瓶中培养的生产者细胞制备携带荧光蛋白Zsgreen1的每种血清型的AAV病毒颗粒。使用该产物纯化AAV溶液,使用AAVPRO滴定试剂盒(用于实时PCR)VER测量病毒滴度。2. SDS-PAGE在每个样本上进行,1 x 109每巷装载的矢量基因组。对于所有血清型中,观察到了AAV衣壳蛋白(VP1,VP2,VP3和)是主要的条带存在,证实了AAV病毒颗粒的纯度。
qPCR快速测定AAV滴度
这个AAVpro滴定试剂盒(Real Time PCR包含用qPCR测定AAV制剂效价所需的所有试剂。AAV粒子从病毒产生细胞中提取,qPCR用于量化病毒基因组序列,在2.5小时内获得滴度。
- 可用于任何AAV血清型的定量基于AAV2的ITR(倒置末端重复)扩增,该区域是大多数AAV载体的共同区域(图5)
- 比常规DNA印迹或ELISA方法更精确定量
图5。利用ITR和CMV启动子靶点进行qPCR测定AAV滴度。使用两个引物组(CMV区域和ITR区域)评价提取的AAV1,AAV2和AAV6颗粒的病毒基因组滴度。在所有血清型中,病毒基因组滴度没有显着差异。
万博体育投注manbetx登录
美国/加拿大:+1.800.662.2566•亚太地区:+1.650.919.7300•欧洲:+33.(0)1.3904.6880•日本:+81.(0)77.565.6999
仅供研究使用。不用于诊断过程。©2021 Takara Bio Inc.保留所有权利。所有商标都是Takara Bio Inc.的财产,或者在美国和/或其他国家或其各自所有者中的联盟。所有司法管辖区不得在所有司法管辖区注册某些商标。Takarabio.com提供了其他产品,知识产权和限制使用信息。