关于AAV交付的常见问题
一般的问题
腺相关病毒的主要特征是什么?
腺相关病毒(AAV)是一种非包膜病毒,属于人类细小病毒家族依赖病毒属。AAV被认为对人类没有致病性,只在有辅助病毒存在的情况下复制,如腺病毒或疱疹病毒。衣壳结构蛋白决定了病毒感染组织/细胞的能力;已知不同血清型的组织特异性不同。
AAV的哪些特征使其成为基因传递的良好载体?
AAV载体利用AAV的特性将基因转导到细胞和有机体。一般认为AAV载体比腺病毒和逆转录病毒载体更安全。AAV载体可用于将基因转入增殖细胞和非增殖细胞,并可在非分裂细胞中进行长期表达。此外,AAV免疫原性较差,适合于基因转导到动物体内在活的有机体内转导工具)。
AAV不同血清型的特征是什么?
血清型根据衣壳结构蛋白的类型进行分类,并决定组织特异性。血清型2(AAV2)是研究最充分的血清型。AAV2具有广泛的组织传染性,是研究中最流行的血清型。血清型5(AAV5)和血清型6(AAV6)具有更特异的组织感染性;AAV5可感染包括中枢神经系统、肝脏和视网膜在内的组织中的细胞,而AAV6可感染包括心脏、肌肉和肝脏在内的组织中的细胞。
我们目前提供AAV2基因传递的生产、纯化和滴定产品。
使用重组AAV时应采取哪些预防措施?
必须充分了解AAV载体的实验室使用的潜在危害和必要的预防措施。病毒可以根据您的基因插入,受到潜在危险的。类似的载体已被批准用于人类基因治疗试验,证明了他们表达基因的潜在能力在活的有机体内.由于这些原因,在生产和处理任何重组病毒时都必须谨慎行事。
遵循涉及重组DNA的研究的所有适用指导。在生产或处理重组AAV时采取适当的安全措施,包括在生物安全柜和穿着防护实验室外套,面部保护和手套上工作。
是否有已发表的AAV2用于体内基因转移的例子?
使用AAVpro系列生成的AAV2颗粒已成功用于在活的有机体内将一种明亮的荧光标记物传递到小鼠大脑某个特定区域的细胞中。
此外,在接下来的研究中,AAV2被用于基因传递(这些例子都没有使用AAVpro产品)。
靶组织 | 描述 | 引用 |
---|---|---|
大脑 | AAV2用于将Cre输送至心室下区 | 李安。,等.睫状神经营养因子受体对成人前脑神经发生的调节。j . >。33,1241-1258(2013)。 |
大脑 | AAV2用于基因直接传递到海马 | Passini妈,等.AAV载体介导的尼曼-匹克a病小鼠模型的脑病理校正摩尔。其他。11, 754–762 (2005). |
肝脏 | 将携带由肝脏特异性启动子控制的基因的AAV2静脉注射给小鼠 | Ziegler RJ,等. 含有肝脏限制性启动子的AAV2载体有助于在Fabry小鼠中持续表达治疗水平的α-半乳糖苷酶a并诱导免疫耐受。摩尔。其他。231 - 240(2004)。 |
胰 | AAV2用于小鼠胰腺基因传递 | 王啊,等.腺病毒和腺相关病毒载体用于胰腺基因传递的比较在活的有机体内.哼基因其他.405 - 413(2004)。 |
一般动物实验应使用多少AAV ?
用量取决于靶组织和给药方法,但对小鼠来说,用量将在1011.和1012.vg/动物(vg=通过实时PCR测量的载体基因组)。然而,确切的剂量应根据经验确定。
重组AAV生产问题
什么是“无助手”生产?
通常,AAV的复制需要辅助病毒,如腺病毒或疱疹病毒。我们的AAV辅助矢量系统在不使用辅助病毒的情况下产生重组AAV(“无辅助”)。相反,包装是通过转染hek293细胞来完成的。AAVpro 293T细胞系)质粒编码制备重组AAV颗粒所需的因素。
“helper-free”生产
哪些细胞适合生产AAV粒子?
对于AAVpro Helper Free系统,使用HEK 293T或HEK 293细胞。
几种HEK 293和HEK 293T细胞系已上市。病毒的产生高度依赖于细胞系的特征。这个AAVpro 293T细胞系*或HEK 293T/17细胞(ATCC,CRL-11268)被推荐用于制备高滴度AAV。
* AAVpro 293T细胞系是转化的人胚胎肾细胞系hek293的亚克隆,具有高转染性,支持高水平的病毒蛋白表达。该细胞系还构成性表达猴病毒40 (SV40)大T抗原。当与AAVpro助手免费系统,这些细胞可产生高滴度的重组腺相关病毒(AAV)。
培养细胞感染不能确定;原因可能是什么?
可能没有产生高滴度的AAV。考虑以下可能的原因:
- 使用的hek293细胞系可能影响AAV的产生。我们建议使用AAVpro 293T细胞系或HEK 293T/17 (ATCC CRL 11268)细胞。我们已经证实这些细胞系可以有效地生产AAV。
- 可能是转染效率低。一定要遵循使用手册中列出的转染方法。
你们提供控制向量吗?
与其他公司的AAV生产套件相比,AAVpro无助手系统有哪些优势?
我们的套件包括表达HSA-MIR342的载体,这是一种增加AAV生产的人MicroRNA。仅与PRC2载体单独相比,该系统将滴度〜2倍。
使用AAVpro无辅助系统(AAV2)制备的AAV颗粒量在10%范围内10.和1011.vg/ 10cm皿(vg =载体基因组,通过实时PCR测量)。请注意,产生的AAV粒子的数量取决于培养条件和靶基因。
AAV净化问题
我想净化我的AAV矢量。您推荐哪个套件?
我们推荐AAVpro纯化试剂盒(所有血清型),因为该试剂盒可用于任何AAV血清型。查看技术笔记»
使用AAVPRO纯化试剂盒(所有血清型)有哪些好处?
超速离心通常用于AAV纯化。但是,这种方法需要高技能水平和几天(2-3)完成。AAVPRO纯化试剂盒(所有血清型)提供了一种简单且快速(〜4小时)的方法,用于从生物生产细胞的任何血清型的AAV颗粒纯化。
![images/Data Image/6416.gif AAVpro纯化试剂盒纯化AAV颗粒的原理图(所有血清型)](http://www.yamajr.com/learning-centers/gene-function/viral-transduction/adeno-associated-virus/images/Data%20Image/6416.gif)
使用AAVpro纯化试剂盒Maxi(所有血清型)的AAV粒子纯化协议概述。
纯化后的AAV可用于在活的有机体内研究。观看视频协议»
AAVpro纯化试剂盒(所有血清型)可用于AAV纯化的细胞数是多少?
AAVpro纯化试剂盒(所有血清型)可从多达5个T225细胞培养瓶中培养的细胞中纯化AAV颗粒。请看下表。
产品 | 猫。# | 血清型(s) | 大小 | 每次净化的烧瓶或盘子数量 |
---|---|---|---|---|
AAVpro纯化试剂盒(所有血清型) | 6675 | 所有 | 4纯化 |
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AAVpro纯化试剂盒Maxi(所有血清型) | 6666 | 所有 | 4纯化 |
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对于动物,如何纯化AAV颗粒?
目前还没有确定的产品纯度标准在活的有机体内转导。您可以通过SDS-PAGE分析确认AAV纯度;应该只有三个主要波段(对应于AAV VP1、VP2和VP3)。
使用AAVpro纯化试剂盒纯化的AAV颗粒(所有血清型)已成功用于在活的有机体内在几种动物中的转导。查看技术笔记»
![images/Data Image/6417.jpg SDS-PAGE凝胶显示使用AAVpro纯化试剂盒收集的1-6血清型病毒颗粒的纯度(所有血清型)](http://www.yamajr.com/learning-centers/gene-function/viral-transduction/adeno-associated-virus/images/Data%20Image/6417.jpg)
来自血清型AAV1,AAV2,AAV3,AAV5和AAV6的病毒颗粒,每种携带荧光蛋白ZSGEEN1,使用AAVPRO纯化试剂盒MAXI(所有血清型)在5 T225烧瓶中培养的生产者细胞纯化。在每个样本上执行SDS-PAGE,其中1 x 109每通道装载的载体基因组。每个血清型样本都有三个与AAV VP1、VP2和VP3相对应的条带。
使用AAVpro纯化试剂盒(所有血清型)的AAV颗粒的标准产量是多少?
使用AAVpro纯化试剂盒(所有血清型)的标准产量如下表所示。
产品 | 猫。# | 每个样品的标准产率范围(real-time PCR) | |
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提取后的收益率 | 净化后的收益率 | ||
AAVpro纯化试剂盒(所有血清型) | 6675 | 4 x 1010.- 2 x 1012.vg / prep. | 1 x 1010.- 5 x 1011.vg / prep. |
AAVpro纯化试剂盒Maxi(所有血清型) | 6666 | 2 x 1011.- 1 x 1013.vg / prep. | 5 x 1010.- 2.5 x 1012.vg / prep. |
病毒基因组
AAV滴定问题
哪些血清型可以用AAVpro滴定试剂盒(用于实时PCR) ver2 ?
该试剂盒中的引物是AAV2的倒末端重复(ITR)区域的特异性。因此,如果使用的AAV向量包括来自AAV2的ITR区域,则可以测量无论血清型如何测量滴度。
与其他传统滴定方法相比,AAVpro试剂盒有哪些优点?
传统上,将插入序列的一个区域用于AAV载体的量化。在此方法下,需要为每一个AAV载体设计引物。AAVpro滴定试剂盒(Real Time PCR) ver2以AAV载体的共同区域,AAV2倒置末端重复(ITR)为靶点。如果载体的ITR区域来自AAV2(大多数常用构建物也是如此),那么无论血清型如何,该试剂盒都可以使用。
AAV提取问题
AAVpro提取液是否与任何AAV血清型兼容?
无论血清型如何,均可使用。然而,与传统方法相比,某些血清型的提取效率较低。对于AAV5,我们发现与冻融方法相比,AAVpro提取液的提取效率较低,但使用AAVpro萃取液时,最终的病毒溶液污染更少。
加入AAV提取液B后,溶液呈粉红色;这是一个问题吗?
根据样品,在添加AAV提取溶液B后,溶液可能会粉红色,但这种颜色变化不会影响提取效率。
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