如何设计sgRNA序列
CRISPR/Cas9基因靶向需要一个定制的单导RNA (sgRNA),它包含一个靶向序列(crRNA序列)和一个Cas9核酸招募序列(tracrRNA)。crRNA区域(如下红色所示)是一个20个核苷酸序列,与你感兴趣的基因区域同源,并将指导Cas9核酸酶的活性。
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使用以下指南来选择与sgRNA的crRNA序列相对应的基因组DNA区域:
目的序列的3'端必须有一个原间隔邻近基序(PAM)序列(5'-NGG-3')。PAM序列上游的20个核苷酸将成为你的目标序列(crRNA), Cas9核酸酶将切割PAM上游的大约3个碱基。
- PAM序列本身是绝对需要卵裂的,但它不是sgRNA序列的一部分,因此不应该包含在sgRNA中。
- 目标序列可以在任何一条DNA链上。
有几种在线工具(例如:CRISPR设计或CHOPCHOP)检测PAM序列并列出特定DNA区域内可能的crRNA序列。这些算法也预测在基因组的其他地方的脱靶效应,允许您为您的研究应用选择最特定的crRNA。请访问我们的关于sgRNA设计工具的页面要学习更多的知识。
通过我们自己的经验,我们确定了设计sgrna的额外技巧。我们发现,对几个被检测的基因来说,最好的sgrna在1号位置有一个G,在17号位置有一个a或T。
设计sgrna的技巧
合成你的sgRNA探索sgRNA在体外转录工具包.在这个试剂盒中,PCR用于生成一个包含sgrna编码序列(由你的crRNA和tracRNA组成)的模板DNA,该序列在T7启动子的控制下。然后,在体外使用PCR产物模板进行转录,用于生产sgrna,可纯化用于效率检测和/或细胞转导。
生产sgRNAs
即使您选择了满足上述所有要求的目标序列,sgRNA的特异性和活性也是不可预测的。因此,通常建议设计多个不同的sgrna来靶向感兴趣的基因。我们的指南-它sgRNA筛选试剂盒提供了简单而健壮的功能在体外方法在细胞转导前评估sgRNA的效率,让您识别最有效的CRISPR。
使用最有效的sgRNA
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CRISPR / Cas9信息
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选择CRISPR/Cas9基因编辑的目标序列
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靶向基因组编辑CRISPR/Cas9系统
基因组编辑CRISPR/Cas9系统概述
CRISPR/Cas9基因组编辑工具
一个成功的基因组编辑工作流程中每个步骤可用的工具的概述。
基因编辑技术说明
使用各种创新工具将Cas9和sgRNA递送到哺乳动物细胞。
SNP工程应用说明
了解在批量编辑或克隆细胞群体中灵敏检测单核苷酸替换的简单分析。
CRISPR / Cas9 gesicles概述
了解guideit CRISPR/Cas9 Gesicle生产系统组件和工作流程。
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指南- SNP筛选试剂盒常见问题
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