批量编辑和克隆细胞群体中特定基因组位点的精确编辑检测
最大限度提高杂合子克隆(WT/SNP)比例的策略之一是使用编码SNP或WT等位基因的等摩尔混合ssodn和沉默突变在PAM网站 (如果可能)作为HDR模板(Paquet et al. 2016)。PAM位点的突变阻止Cas9在任意模板HDR成功后在基因组靶位点切割和产生插入子,间接增加了获得杂合子的可能性。
我们应用这种方法在一个感兴趣的内源性基因中生成了一个C>G替换(S38C)的iPSC杂合子系(出于保密原因未具名)。我们电穿孔两个HDR模板(图4,面板A)编码SNP(蓝色)或WT等位基因(紫色)。SNP的引入导致PAM位点(CCG>GCG)的破坏,编码WT等位基因的寡核苷酸也编码PAM序列中的一个沉默突变(C>G,红色;在20 > CGG)。
Guide-it Knockin Screening Kit被用于在批量编辑人群中成功检测两个模板(SNP或WT沉默)的HDR(图4,面板B)。缺乏绿色和红色荧光信号的细胞electroporated Cas9蛋白质缺乏sgRNA(“消极控制”)或HDR模板(KO)确认flap-probe的特异性寡核苷酸,因为他们没有产生假阳性荧光信号存在的未经审查的野生型序列或indel等位基因。
在编辑和克隆细胞分离和扩增之后,Guide-it Knockin Screening Kit也被用于识别成功编辑的克隆。携带SNP或WT沉默等位基因的克隆分别可以被绿色或红色荧光检测到,但没有杂合子同时携带这两种编辑(产生红色和绿色荧光信号;图4,Panel C)在本实验中被识别,HDR的百分比较低。
图4。在批量编辑和克隆iPSC群体中检测内源性位点的精确编辑。面板。 在匿名兴趣点成功进行HDR后编辑结果。HDR成功后,编辑的基因座将编码SNP(蓝色,小写)或WT碱基(紫色),并结合沉默PAM突变(红色,小写)。面板B。 在批量编辑的ips中成功检测HDR。设计了位移和襟翼探针寡聚体 检测WT静音或SNP等位基因,分别产生红色和绿色荧光信号。在独立实验中,用Cas9蛋白单独(阴性对照)、Cas9- sgrna RNP复合物(KO)或RNP复合物与反义SNP或SNP/WT沉默的ssODN混合物电穿孔细胞。同时检测编码WT沉默或SNP序列的合成寡聚体作为阳性对照。对于每个将ssodn包含在电孔混合物中的编辑场景,使用Guide-it Knockin Screening Kit可以在大群体中成功检测到HDR,由此产生的荧光信号表明。面板C。 克隆细胞系HDR成功检测。从流式细胞术分离的单细胞中获得的克隆被筛选为两种编辑(SNP和WT沉默)。虽然在单独的克隆细胞系中可以检测到成功的任一编辑,但没有发现携带这两种编辑的杂合子克隆。
比较敲入筛选试剂盒和直接Sanger测序的结果
通过Sanger测序证实了导牌引导蛋白筛选的结果。In cases where direct Sanger sequencing of the PCR reaction yielded ambiguous results or traces that were challenging to interpret (e.g., for instances where one of the edited alleles contained an indel), the genomic target region was amplified by PCR and cloned into pUC19 following the protocol of the指导 - IT Indel识别套件 .在每种情况下测序几种细菌克隆证实了引导蛋白筛选试剂盒测定的结果。
将敲除筛查试剂盒的结果与直接Sanger测序进行比较,证明了与解释来自后一种方法的数据相关的挑战,即使使用常用的生物信息学工具分析Sanger数据。为了证明这一点,我们比较了使用敲除筛选试剂盒或Sanger测序获得的结果,以分析在上述未知位点编辑的克隆细胞系(图5)。敲除筛查试剂盒检测到至少存在一个正确编辑的WT等位基因(WT沉默),表明可能存在两个WT沉默等位基因副本,或者可能与编码未编辑野生型序列或indel的等位基因配对。相反,对克隆细胞系扩增的PCR产物进行直接Sanger测序,得到了在感兴趣区域具有重叠峰的测序色谱图(图5,第一个色谱图)。使用常用的生物信息学工具对该测序数据进行分析表明,样本中可能存在不同的等位基因,概率不同(WT,44%;WT沉默,17%;1-bp缺失,14%;另一个1-bp缺失,11%)。使用指南it Indel鉴定试剂盒,确定克隆有一个正确编辑的WT等位基因(WT沉默;图5,中间色谱图)和一个Indel等位基因,带有一个碱基插入(G)和一个7-bp缺失(图5,底部色谱图)。这一结果与敲除筛选试剂盒的输出结果一致,并证明通过Sanger测序的生物信息学分析获得的结果可能具有误导性。
图5.比较指导 - 它敲除筛选套件的结果与 桑格测序。 敲入筛选检测到至少一个正确编辑的WT等位基因(WT沉默;序列)。相反,克隆群体PCR扩增产物的直接Sanger测序得到的测序色谱图在感兴趣的区域有重叠峰(上色谱图)。用常用的生物信息学工具分析这些测序数据表明,不同的等位基因可能以不同的概率出现在样本中。使用Guide-it Indel鉴定试剂盒鉴定该克隆具有一个正确编辑的WT等位基因(WT沉默;中间色谱图)和一个带有一个碱基插入(G)和一个7-bp缺失(底部色谱图)的indel等位基因,结果与Guide-it Knockin Screening Kit输出的结果一致。