限制性内切酶质量控制
每批限制性内切酶的质量检测都是根据以下实验进行的overdigestion测试在哪里底物DNA和过量的酶孵育24小时,发现任何非特异性的DNA酶;2)一个pKF3克隆试验可以鉴定出极少量的外切酶;3)一个ligation-recutting效率测试检测到连接酶抑制剂、磷酸酶或外切酶的任何污染;和4)基因组DNA分析将限制性内切酶添加到适当的细菌基因组DNA中,并在孵育24小时后确认正常的DNA带。
有关我们的QC测试的详细信息,请单击以下信息:
pKF3克隆试验
为了保持我们的限制性内切酶的高质量标准,我们通过酶切pKF3强制克隆载体DNA的多个克隆位点(MCS)中的一个独特位点来进行pKF3克隆测试。pKF3 DNA的MCS也编码rpsL基因盒。当rpsL是链霉素(Sm)敏感的表型,否则是Sm抗性的宿主。当限制性内切酶被微量核酸酶如核酸外切酶污染时,酶的缺失rpsL基因盒发生突变,寄主对Sm保持抗性。利用这一特性,即使是少量的核酸酶污染也能被检测到。
下表列出了我们使用pKF3克隆试验进行质量检测的限制性内切酶:
AccIII | Aor13HI | Aor51HI | AvaII | 巴厘岛 | ||
BamHI | BanII | BglII | BspT104I | BstPI | ||
Bst1107I | ClaI | EcoO65I | EcoRI | EcoT14I | ||
Eco52I | FbaI | HindIII | 高致病性禽流感 | KpnI | ||
MluI | NcoI | 心好 | NotI | NsbI | ||
PshBI | PstI | PvuI | PvuII | 尚驰 | ||
SacII | 萨利· | SmaI | SphI | Sse8387I | ||
StuI | VpaK11BI | XbaI | XhoI |
pKF3克隆测试原理
pKF3克隆测试协议
- pKF3 DNA被过量10倍的限制性内切酶酶切,该酶在MCS中有一个独特的位点。
- 在失活处理后,将部分消化的DNA在16°C下连接30分钟DNA连接试剂盒Ver. 1.
- 用部分反应液转化TH2感受态细胞,在37℃下,在LB-Cm- sm板(含氯霉素和链霉素)和LB-Cm板(含氯霉素)两种平板上培养两晚。
在没有核酸外切酶污染的情况下,LB-Cm-Sm板上不会出现菌落,因为获得的转化体对链霉素敏感。当存在污染时,LB-Cm-Sm平板上的菌落将会减少rpsLgene-deficient细菌。微量核酸外切酶的存在与否可由LB-Cm-Sm平板上有无菌落来决定。
为了通过我们的质量保证测试,比例rpsL基因缺陷转化体(LB-Cm- sm板上出现的菌落数量)与转化体(LB-Cm板上出现的菌落数量)必须小于2%。
文化组成
LB-Cm-Sm板
酵母提取物:5 mg/ml
Pepton: 10毫克/毫升
生理盐水:5毫克/毫升
氯霉素:30µg / ml
链霉素:50µg / ml
琼脂:1.5%
LB-Cm板
酵母提取物:5 mg/ml
Pepton: 10毫克/毫升
生理盐水:5毫克/毫升
氯霉素:30µg / ml
琼脂:1.5%
结扎和切割效率测试
我们进行结扎和切割试验,以评估和维持我们的酶的功能纯度。任何连接酶抑制剂、磷酸酶或外切酶的污染都将被本试验检测到:首先,底物DNA被过量使用2- 50倍的限制性内切酶过度消化。将酶切后的DNA回收,用T4 DNA连接酶缓冲液[66mm Tris-HCl (pH7.6), 6.6 mM MgCl]稀释210 mM DTT, 0.4 mM ATP]在5'端浓度为0.1-1.0µM。加入足够量的T4 DNA连接酶后,在16℃下孵育1小时或16 - 18小时。回收的DNA再用反应缓冲液稀释,然后用相同的限制性内切酶重新切割。
下表列出了我们限制性内切酶组合的连接和切割效率:
|
|
|
*用消化后的DNA进行连接DNA连接试剂盒,第2.1版26°C孵育10分钟。
基因组DNA分析
当使用限制性内切酶来消化和分析基因组DNA时,可能有许多限制性内切酶可用,这取决于基因组DNA的来源。为了只提供最合适的限制性内切酶,我们通过切割合适的细菌基因组DNA(琼脂糖包埋;0.5µg DNA/50µl凝胶),然后进行脉冲场电泳以确定DNA带型。
我们的质量保证测试包括添加5、10、20和50单位的每种酶,然后孵育5和20小时,以确定完全消化所需的最低酶量。
下表列出了在各种实验条件下完全消化细菌基因组DNA所需的最小酶切量。
基因组DNA QC | 完全消化所需的酶量 | |||||
---|---|---|---|---|---|---|
限制 酶 |
识别 序列* |
基因组DNA QC | 反应 缓冲* * |
反应 温度(°C) |
所需的酶量 完全消化 |
|
孵化 5人力资源 |
孵化 20小时 |
|||||
AatII | GACGTC | 金黄色葡萄球菌 | T + BSA | 37 | 50 | 5 |
Aor51HI | AGCGCT | 金黄色葡萄球菌 | 米 | 37 | 50 | 20. |
BglI | GCCNNNNNGGC | 金黄色葡萄球菌 | 基底 | 37 | 10 | 5 |
BlnI | CCTAGG | 大肠杆菌 | K | 37 | 5 | 5 |
BspT104I | TTCGAA | 节细菌属危害 | l | 37 | 40 | 5 |
BssHII | GCGCGC | 金黄色葡萄球菌 | 米 | 50 | 5 | 5 |
Bst1107I | GTATAC | 节细菌属危害 | K | 37 | 5 | 5 |
ClaI | ATCGAT | 节细菌属危害 | 米 | 30. | 50 | 20. |
CpoI | CGGWCCG | 金黄色葡萄球菌 | K | 30. | 5 | 5 |
DraI | TTTAAA | 铜绿假单胞菌 | 米 | 37 | 100 * * * | 100 * * * |
Eco52I | CGGCCG | 金黄色葡萄球菌 | 基底 | 37 | 10 | 5 |
MluI | ACGCGT | 金黄色葡萄球菌 | H | 37 | 5 | 5 |
市政 | CAATTG | 节细菌属危害 | M + BSA | 37 | 5 | 5 |
NaeI | GCCGGC | 金黄色葡萄球菌 | l | 37 | 50 | 50 |
NheI | GCTAGC | 节细菌属危害 | 米 | 37 | 50 | 20. |
NotI | GCGGCCGC | 大肠杆菌 | H + BSA + Tri。 | 37 | 5 | 5 |
NruI | TCGCGA | 金黄色葡萄球菌 | 基底 | 37 | 50 | 5 |
NsbI | TGCGCA | 节细菌属危害 | T + BSA | 37 | 5 | 5 |
PshBI | ATTAAT | 铜绿假单胞菌 | 基底 | 37 | 5 | 5 |
Psp1406I | AACGTT | 节细菌属危害 | T + BSA | 37 | 5 | 5 |
PvuI | CGATCG | 黄杆菌属okeanokoites | K + BSA | 37 | 20. | 5 |
SacII | CCGCGG | 金黄色葡萄球菌 | T + BSA | 37 | 10 | 5 |
萨利· | GTCGAC | 金黄色葡萄球菌 | H | 37 | 150 | 5 |
SfiI | GGCCNNNNNGGCC | 大肠杆菌 | 米 | 50 | One hundred. | 50 |
SmaI | CCCGGG | 金黄色葡萄球菌 | T + BSA | 30. | 5 | 5 |
SmiI | ATTTAAAT | 大肠杆菌 | H | 30. | 50 | 5 |
SnaBI | TACGTA | 节细菌属危害 | 基底 | 37 | 10 | 10 |
SpeI | ACTAGT | 大肠杆菌 | 米 | 37 | 50 | 20. |
Sse8387I | CCTGCAGG | 金黄色葡萄球菌 | M + BSA | 37 | 5 | 5 |
SspI | AATATT | 节细菌属危害 | 基底 | 37 | 5 | 5 |
XbaI | TCTAGA | 大肠杆菌 | M + BSA | 37 | 50 | 5 |
XhoI | CTCGAG | 大肠杆菌 | H | 37 | 20. | 5 |
W: A或T, N: A或C或G或T
**0.5µg DNA/50µl凝胶+ 100µl反应混合物
*** DraI在琼脂糖凝胶中的反应非常缓慢,所以添加最优量,并在4°C下保存16小时。然后将样品转移到37℃,孵育5或20小时。
产品引用
完整的AvrII限制图大肠杆菌几个实验室菌株的基因组和比较。核酸Res。18,2649 - 51(1990)。
麦勒兰,琼斯,R.,帕特尔,Y. & Nelson, M.限制性内切酶的脉冲场绘制细菌基因组。核酸Res。15日,5985 - 6005(1987)。
限制性内切酶表观切割特异性的增强:应用于染色体megabase作图。基因Amplif。肛交。5,257 - 82(1987)。
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