测试In-Fusion技术
融合克隆技术是在并行实验中针对吉布森的方法提出的。在所有情况下,克隆载体均使用pUC19,并用BamHI线性化。每个克隆系统在其自身克隆协议的推荐条件下进行测试,并使用吉布森的多插入克隆酶混合物进行额外测试。Gibson的方法指出,对于四个片段(三个插入物)组装体,培养时间应从15分钟增加到60分钟。为了与融合内克隆进行更直接的比较,吉布森混合酶的多插入实验也在更短的融合内克隆反应时间下进行。然后将所有克隆反应转化为恒星活性细胞,每个反应的1/10被接种。菌落计数和克隆序列验证用于评估每个反应的结果。测序数据是克隆准确性的最精确测量,因此比简单地比较菌落总数提供了更多信息。多插入克隆(表一)和单插入克隆(表二)的结果如下所示。
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在融合克隆 |
吉布森法 (短潜伏期) |
吉布森法 (长孵化) |
条件 |
在50°C孵育15分钟 |
在50°C孵育15分钟 |
在50°C孵育60分钟 |
向量+插入 |
89年殖民地 |
111年殖民地 |
392个殖民地 |
阴性对照(无插入) |
1菌落 |
39个殖民地 |
78年殖民地 |
克隆准确性 |
100%(26/26正确的殖民地) |
19%(5/26正确殖民地) |
73%(19/26正确殖民地) |
表I.多插入克隆的结果。在每个反应中使用三个片段(除了2.7kb的线性化载体骨架外)作为插入物:MBP(1.1kb)、PROF12(0.7kb)和AcGFP1(0.7kb)。总质粒大小为5.2kb。
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在融合克隆 |
吉布森法 |
条件 |
在50°C孵育15分钟 |
在50°C孵育15分钟 |
向量+插入 |
635个殖民地 |
401年殖民地 |
阴性对照(无插入) |
1菌落 |
39个殖民地 |
克隆准确性 |
100%(26/26正确的殖民地) |
96%(25/26正确菌落) |
表二。单插入克隆结果。一个片段(MBP);1.1 kb)作为插入物与线性化的载体骨干(2.7 kb)。最终质粒大小为3.8 kb。
精确计数每次都能得到正确的克隆
对于单插入反应,In-Fusion技术显示了预期的高水平克隆准确性。Gibson的技术在使用In-Fusion克隆条件时显示了相当的准确性。然而,Gibson方法阴性对照的菌落数量远高于in - fusion克隆,这表明当使用in - fusion酶时,克隆机制更加精确、可靠。
无论插入的数量或反应条件如何,在使用In-Fusion技术时观察到的背景始终低于Gibson方法。这种差异在多插入克隆中尤其显著,在多插入克隆中菌落的总数通常会减少,假阳性会带来更大的问题。In-Fusion克隆的高准确率在多片段克隆的要求下大放异彩——阴性对照反应导致菌落数量极低,克隆准确率达到100%。相比之下,Gibson的克隆方法缺乏使用In- fusion克隆的条件或Gibson推荐的条件(需要四倍的时间)来执行。