在融合克隆技巧和常见问题
我们的克隆专家已经创建了一系列提示和常见问题,以回答您的克隆问题,并为您的下一个克隆或突变项目提供融合克隆的最佳实践。
如果你准备好了,选择你的核聚变套件现在。
常见问题解答:
一般资料
什么是融合克隆?
融合克隆是一种高效、不依赖于连接的克隆方法,基于克隆插入物互补端的退火和线性化克隆载体。这项技术确保了将任何感兴趣的基因简单、单步定向克隆到任何位点的任何载体中。融合内结构是无缝的,能够在没有任何干扰“scar”序列的情况下实现翻译阅读帧连续性。
融合克隆的效率如何?
单个插入载体的克隆效率至少为95%。与转化效率不同,转化效率仅仅衡量获得的转化菌落的数量,克隆效率是衡量准确性的指标,它提供了从克隆反应中获得的正确克隆数量的信息。
融合克隆是如何工作的?
在融合克隆中,如果多个插入物要同时连接,则在克隆插入物和线性克隆载体的末端或相邻克隆插入物的末端需要15 bp的重叠。对于多插入克隆,我们建议将重叠部分增加到20 bp。
这些15 bp的同源重叠可以通过PCR扩增或寡聚合成任一克隆组分。不推荐短于12nt或长于21nt的同源重叠。融合结构的翻译阅读框的连续性可以通过在插入特异性序列和15 nt重叠之间添加核苷酸来调节。15 bp的互补区域必须位于相邻DNA片段的末端,否则它们将不会被融合克隆连接。
融合酶混合物在克隆插入刀片和线性化克隆载体的末端产生单链5'突出。这些悬垂在互补位点退火,重组圆形构建体被救出大肠杆菌。(我们不推荐使用能力小于10的单元格8融合克隆不允许线性DNA分子的共价组装。
![images/Data Image/InFusionCloning-single-insert_8559_0321_T.gif in - fusion协议克隆任何插入到任何向量在最少15分钟](http://www.yamajr.com/learning-centers/cloning/images/Data%20Image/InFusionCloning-single-insert_8559_0321_T.gif)
融合内克隆协议的简要概述。
融合捕捉组件和融合捕捉组件Ecodry的差异是什么区别?
在融合快速组装包括液体在熔合Snap组装主混合,然而In - Fusion Snap Assembly EcoDry包括预上等离子化的冻干的内熔卡组件主混合物。Ecodry套件可最大限度地减少处理并在室温下储存。液体和冻干的主混合物均具有15分钟的克隆反应。
什么是克隆增强器?
克隆增强剂或Ce是一种专有的酶混合物,用于去除背景质粒DNA和PCR残基,从而消除了在融合反应之前对PCR扩增的DNA进行额外纯化的需要(参见细节融合卡套装用户手册)。CE可用作单独的项目.
只有当PCR扩增产生预期大小的单个PCR片段,而没有背景涂片时,使用CE才合适。CE是一种方便的高通量应用工具,使用高度优化的PCR循环条件和引物,生成预期大小的干净DNA片段。
不需要加入CE至融合反应混合物,也没有增加克隆效率 - 它只是取代标准纯化步骤,条件是PCR产生高质量的结果。
融合内克隆方法是否会在序列中引入错误?
在融合克隆酶中,我们没有看到任何碱基滑动、碱基添加或碱基缺失。在In - Fusion克隆之后,我们克隆并测序了超过4000个单独的克隆和各种人类开放阅读框,很少看到克隆连接处出现错误的证据(<2%)。我们遇到的大多数序列错误显然是由于引物合成的错误(也就是说,它们出现在包含特定插入物的所有或许多克隆中)。In - Fusion Cloning是制作无错误融合结构的理想方法。
融合克隆主混合物的稳定性如何?
In - Fusion Cloning主混合已经经过设计,以提高稳定性,不需要稀释,可以在-20°C(液体版本)或室温(EcoDry版本)下存储。
在融合快速组装
融合捕捉组件和融合高清克隆有什么区别?
在融合快速组装提供了与Fusion HD克隆相同的优势,并使用了相同的简化协议,但是产生更高的效率(菌落数量)和一致性,尤其是具有挑战性的项目,如多片段克隆。
融合内HD和融合内Snap组装束包括不同的PCR聚合酶。我是否应该期望性能有所不同?
不。虽然In-Fusion HD捆绑包包括CloneAmp HiFi PCR预混料和In-Fusion Snap Assembly捆绑包包括PrimeSTAR Max PCR预混料,这两种酶提供异常高保真度,并将给您相同的信任结果。
融合的捕捉组件如何与NeBuilder Hifi DNA组装进行比较?
In-Fusion Snap Assembly生产更多殖民地在大多数克隆实验(如单插入克隆、大载体克隆和定点突变)中均优于NEBuilder HiFi,且总能获得>90%的克隆准确率。对于多插入克隆,In-Fusion Snap Assembly只需要15分钟的孵育,而NEBuilder HiFi则需要60分钟。
插入和底漆设计
促进成功融合克隆反应的同源重叠的要求是什么?
同源重叠对于融合克隆是必需的。适当的同源性由与线性化克隆载体或克隆插入件的5'末端互补的15nt DNA序列组成。对于多插入克隆,我们建议将同源性提高到20.1吨。图2和3中的数字融合卡套装用户手册或者In - Fusion Snap Assembly EcoDry用户手册提供详细的例子。
我如何在克隆插入的末端和线性化的向量之间产生同源重叠?
利用引物对克隆插入物进行PCR扩增,使其与线性化载体(或邻近克隆插入物)末端的15 nt 5'悬吊物相互补。
或者,通过反PCR将15 nt的同源性添加到线性化的载体中,使其与克隆插入部分重叠。如果要克隆合成的寡核苷酸(≥50 bp),这些寡核苷酸可能携带与线性克隆载体末端或邻近DNA片段同源的15 nt 5'悬垂物。高质量、非磷酸化寡聚体与In - Fusion克隆兼容。
如何设计携带15-NT悬垂的PCR引物与线性化载体或相邻插入物的终端互补的互补?
每个前进(5'→3'感测链)和反向(5'→3'反义链)PCR引物应包括以下内容:
- 在其3'末端的模板特异性(基因特异性)部分。为保证PCR扩增的特异性和有效性,引物的模板特异性部分长度应为18-25 nt。
- 引物5'端的15 nt同源性,与线性化载体或相邻插入物的末端互补(如果同时克隆多个插入物).对于多插入克隆,我们建议将同源性增加到20 nt。不建议短于12 nt和长于21 nt的同源重叠。15 bp互补区必须位于相邻DNA片段的末端,否则不会通过融合克隆连接。
- (可选)为确保翻译阅读框的连续性,或保留限制性位点,可在模板特异性部分和15 nt同源重叠部分之间添加额外的核苷酸到PCR引物中。
pcr扩增插入物的末端与线性化克隆载体的同源重叠的最佳长度是多少?
当前In - Fusion反应条件有利于单插入克隆的15 bp同源重叠,有利于多插入克隆的20 bp同源重叠。我们不建议使用短于12bp或长于21bp的重叠。
有哪些工具可以帮助设计与融合克隆兼容的PCR引物?
In - Fusion PCR引物的设计说明包含在所有In - Fusion克隆用户手册中。此外,我们的在线引物设计工具兼容Mozilla Firefox或谷歌Chrome浏览器(Internet Explorer不兼容primer design Tool)。
我们还建议SnapGene查看器作为一个有用的,免费的在线工具在网上重组构建体的组装、融合PCR引物的手动设计以及翻译阅读框连续性的调整。
为什么同源重叠对融合克隆反应很重要?
内融合克隆反应的机制使用3'外切酶在线性双链DNA的末端产生单链5'悬垂物。这些DNA片段然后通过在插入物末端的互补的15 nt重叠和线性化的载体退火。该载体可通过反PCR或限制性内切酶进行线性化。限制性消化可以用一种或多种酶进行,这些酶可产生5'悬垂(例如,EcoRI, BamHI)、3'悬垂(例如,KpnI)或钝端(例如,HpaII)。
下面的图表显示了在运作中的融合克隆机制的具体例子:
如果向量通过限制摘要线性化,生成5'或3'悬垂,我如何计算15 nt重叠?
限制用地的5'突出部分包括在15新界补充区内。限制用地的3'突出部分不包括在15新界补充区内。中的图2和图3融合卡套装用户手册或者In - Fusion Snap Assembly EcoDry用户手册提供详细的例子。
通过在PCR引物中添加核苷酸,在模板特异性部分和15 nt同源重叠部分之间,可以在重组载体中保留用于载体线性化的限制位点。在线引物设计工具允许您选择是否保留限制站点。(Primer设计工具与Mozilla Firefox或Google Chrome web浏览器兼容,但与Internet Explorer不兼容)。
在执行融合克隆时如何更改阅读框?
读取框由引物序列定义。例如,当产生融合蛋白时,如果融合PCR引物序列的5'末端的矢量同源物的15bp对应于载体阅读框的最后五个密码子,则可以克隆新的基因或标签the same reading frame downstream of the C-terminus of the vector sequence by placing the first codon of this gene next to the last codon of the homology sequence (i.e., at the 3' end) without any interfering STOP codons. To shift the reading frame, you would simply add one or two additional bases after the 15-bp homology and before the first codon of the target gene. For example:
5' 15 nt与载体序列同源性 | 维持读框所需的基数 | In - Fusion PCR引物的3'基因特异性序列 |
---|---|---|
Gta TTC atc CGG CCG |
0 | Atg GGC CTT tac cca act CGC |
g tat tca tcc ggc cg |
1 | Atg GGC CTT tac cca act CGC |
Gt att cat CCG GCC g |
2 | Atg GGC CTT tac cca act CGC |
我如何在相同的翻译阅读框架中克隆我感兴趣的基因,作为克隆载体中的标签(如荧光蛋白、Myc、HA等)?
在PCR引物的基因特异性部分的长度内,或通过在基因特异性部分和PCR引物的15 nt同源性之间添加核苷酸,调整带有标签的翻译阅读框的连续性。
请注意我们目前的在线版本引物设计工具不允许对平移读取帧连续性进行调整。因此,底漆顺序应由用户手动设计;我们推荐SnapGene查看器作为一个有用的,免费的在线工具来帮助完成这个任务。
融合内PCR引物中可以包含小的外部序列吗?
是的,可以在模板/基因特异性部分和融合PCR引物的15 nt同源重叠部分之间添加外部核苷酸序列(例如,小标签、Kozak序列、限制性位点等)。
对于in - fusion克隆,如果15-bp的同源区域在载体中出现不止一次,这是一个问题吗?会产生多重重组产物吗?
除载体线性化位点相邻的网站的内部重组事件非常罕见。因此,即使您在载体序列中存在多次以上的所需的同源区域,也不太可能发生不需要的重组事件。
我是否需要使用磷酸化PCR引物进行融合克隆?
不-融合克隆不需要使用磷酸化的寡核苷酸。
融合PCR引物需要哪种寡核苷酸质量?
融合PCR引物应为通过脱盐纯化的高质量寡核苷酸。不需要凝胶或HPLC纯化。
推荐哪些PCR聚合酶用于扩增In-Fusion克隆插入物?
融合克隆与任何PCR聚合酶兼容。3'悬垂不干扰克隆反应。
为了确保无差错的插入,请使用具有高校对活动的聚合酶,如PrimeSTAR Max DNA聚合酶(提供一些内融合的卡扣捆绑包)。这种聚合酶是高度健壮和准确的,可扩增到6 kb的人类基因组DNA, 10 kb的大肠杆菌基因组DNA和15 kb的lambda DNA。它与两步或三步PCR循环兼容,并且在富含gc的模板上显示最小的错误率。
pcr产生的3' a悬垂干扰融合克隆吗?
不,3'A悬垂不会干扰融合克隆机制。
我可以克隆多个片段到一个载体在一个单一的融合克隆反应?
是的,我们已经成功测试了多重碎片克隆最多五次插入(克隆示意图和克隆屏幕结果分别见下图和下表)。
多片段克隆的引物设计可以通过我们的在线引物设计工具. (Primer设计工具与Mozilla Firefox或Google Chrome web浏览器兼容,但与Internet Explorer不兼容。)请注意,在两个相邻片段之间,In - Fusion反应只需要一个同源重叠。这个重叠可以位于任何一个片段上。
![同源重叠有助于在单一反应中无缝克隆多个片段](http://www.yamajr.com/learning-centers/cloning/images/200-Cloning/CC-TechFigs/InFusion-FAQ-B16_2849_T.gif)
融合克隆具有在单一反应中克隆多个片段的改进能力。使用这个系统,同时克隆多达4个1-kb的片段就像克隆单个片段一样容易。这将节省数周的时间,否则将花在筛选克隆和亚克隆。
插入 | 菌落筛选 | |
---|---|---|
碎片 | 殖民地,1/5镀 | 正确的克隆 |
1KB+1KB | 2,128 | 10/10 |
1 kb + 1 kb + 1 kb | 83 | 7/10 |
1kb + 1kb + 1kb + 1kb | 31 | 8/10 |
1kb + 1kb + 1kb + 1kb + 1kb | 14. | 4/10 |
我可以在插入和向量或相邻插入之间拆分同源的15 nt重叠吗?
是的。同源的15 nt重叠可以在相邻的DNA片段之间分裂。然而,只有通过反PCR将载体线性化,才能将插入物与载体的重叠部分分离。
这一选项的初级设计不容易通过在线引物设计工具.我们推荐SnapGene查看器作为一个有用的,免费的在线工具来帮助完成这个任务。
下图显示了融合引物设计和互补链的退火,使用片段1(红色)和片段2(蓝色)之间的15nt重叠分裂:
我必须在进行融合克隆反应之前净化pcr扩增的插入物和/或载体吗?
是的,pcr扩增的DNA必须在融合克隆之前进行纯化。PCR之后,用琼脂糖凝胶电泳验证你的目标片段已经扩增。如果获得所需大小的单个条带,则可以要么旋转柱净化(核旋蛋白凝胶和PCR清理)或者处理你的PCR产物克隆增强器(CE).但是,如果凝胶上可见非特异性背景或多个条带,则通过凝胶提取分离目标片段。如果你用聚合酶链反应来扩增你的载体并插入,你同时得到一个聚合酶链反应扩增的载体和没有非特异性背景的pcr扩增片段,您可以使用附录A中提供的快速融合克隆协议融合高清克隆工具包用户手册.
- 核旋蛋白凝胶和PCR清理
- 凝胶提取能够从背景PCR副产物或其他污染物中选择所需大小的特定DNA片段。
- 如果PCR不能产生背景涂片,则柱纯化是适当的。
- 克隆增强器(CE)
- 这种专有的酶混合去除背景质粒DNA和PCR残留。
- CE适用于产生预期大小的单个片段而不需要背景涂片的PCR。
- CE是HTP应用的一个方便工具,它采用高度优化的PCR循环条件和引物,从而使PCR产生预期大小的干净DNA片段。
注意:在大多数情况下,CE处理不需要额外的柱净化或凝胶萃取。然而,为了确保更好的克隆结果,PCR线性化载体可能需要结合CE处理,然后凝胶提取,从可能的PCR副产物中分离线性化载体。
与融合克隆兼容的最大DNA片段是什么?
该技术已针对克隆大碎片进行了优化。使用融合克隆已经成功地克隆到PUC19中的DNA插入物。
![大片段DNA融合克隆成功率高](http://www.yamajr.com/learning-centers/cloning/images/200-Cloning/CC-TechFigs/InFusion-FAQ-B19_1882_T.gif)
克隆15kb大小的片段时,十个克隆中有十个包含正确的插入片段(克隆效率100%)(克隆PCR筛选结果证实)。
什么是与融合克隆相容的最小DNA片段?
用In - Fusion克隆成功克隆的最小插入片段是一个50 bp的合成寡核苷酸(包括两个与载体末端重叠的15 nt同源序列)。
对于短合成寡聚体(50 - 150 bp)的In - Fusion克隆,建议寡聚体与载体的摩尔比为5-15:1。根据寡聚体长度的不同,最佳比例必须由经验来确定。
注意:非磷酸化寡核苷酸与In - Fusion克隆兼容。然而,in - Fusion酶混合中的3'外切酶活性需要末端3' OH基团。
向量
克隆载体的克隆载体与融合克隆兼容?
任何线性载体都与融合克隆兼容。线性化可以通过以下方式之一完成:
- 限制摘要包含一个或多个限制性内切酶.
- 对于高效的In - Fusion克隆,线性化载体末端的完整性是至关重要的。我们建议使用高质量的限制性内切酶,进行数小时的消化。然而,夜间限制消化是不可取的。
- 载体末端不需要去磷酸化;该载体不会在融合克隆反应混合中再循环,除非它在其末端携带15 nt互补重叠。
- 将引物定位在所需的克隆位点进行反PCR。
- 克隆位点的选择是灵活的,因为不需要适当的限制位点。
- 同时PCR介导的突变(缺失、插入、碱基改变)是可能的。
- 可将15 bp同源重叠添加到PCR线性化载体中。
- 通过使用具有高校对活性的PCR聚合酶来保持载体主干的完整性,如PrimeSTAR Max DNA聚合酶(提供一些内融合的卡扣捆绑包)。这种聚合酶是高度健壮和准确的,可扩增到6 kb的人类基因组DNA, 10 kb的大肠杆菌基因组DNA,或15 kb的lambda DNA。它与两步或三步PCR循环兼容,并且在富含gc的模板上显示最小的错误率。
通过限制性消化线性化的载体应该用准备好的琼脂糖凝胶(用铝箔覆盖以防止DNA损伤)纯化。电泳应在低电压下进行,以确保线性和圆形(未切割)矢量分子的分离。
通过反向PCR线性化的载体应使用克隆增强器(CE)破坏亲代质粒。经过ce处理的PCR线性化的载体可能需要琼脂糖凝胶电泳进一步纯化,如果线性化的载体prep中存在PCR副产物。
融合克隆是否保留了用于线性化载体的限制位点?
为了保持限制性位点,可以将核苷酸添加到模板特异性部分和15-NT同源重叠之间的PCR引物中。
在线引物设计工具允许您选择是否保留限制网站。(Primer Design Tool与Mozilla Firefox或Google Chrome web浏览器兼容,但与Internet Explorer不兼容。)
为了融合克隆,我必须去磷酸化线性化载体的末端吗?
不,在融合克隆中,载体末端去磷酸化既不需要也不推荐。
大型克隆载体与融合克隆兼容吗?
是的,融合技术可以在单一反应中轻松地将单个或多个DNA片段直接克隆到大型载体(例如,在32.6-36kb时),无需中间克隆到转移/梭子载体中。(请参见图1,2,5和表IIIAdeno-X腺病毒系统3小册子详情请参阅。)
与携带重复序列的载体相容是融合的克隆吗?
是的 - 我们的科学家经常使用融合克隆到携带长终端重复(LTR)的慢病毒或逆转录病毒载体中的转基因,以及携带倒置终端重复的腺病毒载体(ITRS)。
应用程序
我可以用融合克隆来组装共价连接的线性DNA分子吗?
不,融合克隆不允许共价连接线性DNA分子的组装。
In - Fusion克隆试剂盒组件包括线性化克隆载体,能够抢救In中的圆形重组结构大肠杆菌。
我可以使用一个循环克隆载体的融合克隆?
不,循环克隆载体与融合克隆不兼容。载体必须通过限制性内切酶或反PCR进行线性化。
我可以使用融合克隆来克隆限制性消化产生的DNA片段吗?
是的,如果邻近的DNA片段/寡聚体或线性化的载体携带15 bp的同源重叠,需要退火。在pcr线性化载体或合成寡核苷酸的末端可以添加与酶切克隆插入物重叠的15 bp。
如果互补位点与线性化的载体末端有一定距离,In-Fusion技术是否允许克隆插入物?
不同源的15-bp重叠应准确定位在载体末端并插入。不位于相邻DNA片段末端的15 bp互补区域不会被In - Fusion克隆连接。PCR线性化载体可以将引物定位到所需的克隆位点,从而在末端产生15 bp的重叠。
我可以使用融合克隆进行诱变吗?
是的,融合克隆允许单个或多个碱基改变、删除和插入。详情请参阅突变与融合克隆技术报告。
使用融合克隆,我可以克隆寡核苷酸/ shRNA寡核苷酸吗?
是的,可以使用融合克隆克隆与线性载体的末端具有同源寡核苷酸(≥50bp)的合成寡核苷酸(≥50bp)。对于合成短寡聚体(50 ~ 150 bp)的克隆,建议寡聚体与载体的摩尔比为5-15:1。根据寡聚物的长度,最佳的摩尔比必须由经验来确定。
注意:非磷酸化寡核苷酸与In - Fusion克隆兼容。然而,in - Fusion酶混合中的3'外切酶活性需要末端3' OH基团。
我可以用融合克隆来克隆富含gc的DNA片段吗?
是的,但应特别考虑相邻DNA片段的同源重叠。由于内融合克隆基于这些重叠的退火,因此将GC含量考虑到15-BP同源性。我们没有具体数据,显示当前融合克隆主混合性能的可变性,具体取决于15-BP重叠的GC含量。但是,使用先前版本的Kit-inusion优势获得以下结果:
- GC含量为20-40%的15 bp同源重叠对In - Fusion Advantage的克隆效率影响不大或没有影响。
- 在某些情况下,GC含量为60-80%的15 bp同源重叠表明In - Fusion Advantage的克隆效率降低。
提示
什么是推荐插入载体摩尔比的融合克隆?
融合克隆使用一种非常强健的酶,在大多数情况下都可以进行高效克隆。关于插入/载体数量的一般性建议包含在所有当前的融合内克隆用户手册中。
- 为了确保在标准条件下或在执行单片段或多片段克隆时获得最佳结果,请使用2:1的插入与向量比率。
- 对于线性化,纯化的载体,每个刀片中的每一个的摩尔比应为2:1。具有一个载体的两种插入件的摩尔比应为2:2:1。
- 为了计算每个DNA片段所需的数量,使用不少于20ng的最小插入片段,并相应地计算其余片段的数量,保持2:1的插入与向量摩尔比。每一个插入应该以2:1的摩尔比与向量计算。
- 对于小片段(150 ~ 350 bp)的克隆,建议插入-载体摩尔比为3-5:1。
- 对于合成短寡聚体(50 ~ 150 bp)的克隆,建议寡聚体与载体的摩尔比为5-15:1。根据寡聚物的长度,最佳的摩尔比必须由经验来确定。
- 非磷酸化寡核苷酸与In - Fusion克隆兼容。然而,in - Fusion酶混合中的3'外切酶活性需要末端3' OH基团。
使用我们的在线摩尔比计算器根据摩尔比、插入长度(bp)和向量长度(bp)计算具体的插入到向量的数量。
我可以修改同源重叠的长度吗?将更长的重叠改善融合克隆效率吗?
当前的In - Fusion克隆反应条件有利于单插入克隆的15 bp同源重叠,有利于多插入克隆的20 bp同源重叠。我们不建议使用短于12bp或长于21bp的重叠。
如果我对融合内克隆反应使用更长的培养时间,克隆效率会提高吗?
不,不建议增加融合反应时间。这可能会在克隆插入物和载体的末端产生不均匀的单链区域,导致同源重叠的低效退火,从而降低克隆效率。
我可以使用TOP10细胞进行融合克隆吗?
前10名细胞或其衍生物(例如。,ccdB生存2 t1r大肠杆菌)和相关菌株(如DH10B、MC1061)在融合克隆中是次优的,导致重组克隆数量较低。如果您正在执行多片段克隆或使用低复制数向量,这可能特别需要关注。
我们建议使用恒星主管细胞,这是优化使用在融合克隆和包括在所有当前工具包。
哪些菌株与融合克隆兼容?
融合克隆需要具有胜能的细菌细胞不少于108cfu /µg超螺旋DNA。
- 恒星主管细胞(包括在所有当前的融合内克隆套件中),以及任何通用克隆大肠杆菌菌株,应与融合克隆兼容。
- 星状活性细胞已被验证用于克隆和扩增大型载体(如BAC、FOSMID)和具有重复序列的载体,如逆转录病毒/慢病毒载体中的长末端重复序列(LTR),或腺病毒载体中的反向末端重复序列(ITR)。
- 前10名细胞或其衍生物(例如。,ccdB生存2 t1r大肠杆菌)和相关菌株(如DH10B、MC1061)在融合克隆中是次优的,导致重组克隆数量较低。如果您正在执行多个片段克隆,或使用低拷贝数向量,这可能特别关注。
我们不建议将In - Fusion反应混合物转化为以下任何一种:
- 大肠杆菌菌株缺乏recA1或者恩达突变
- 大肠杆菌针对特定应用的菌株(例如,大规模的蛋白质表达)
- 革兰氏阳性菌株
- 细菌细胞携带nupG(提奥)突变
注意:如果绝对有必要使用未经In - Fusion克隆验证的特定菌株,则将反应混合物稀释为1:5可能会提高转化效率。
我能在比用户手册中建议的更大的数量上转换in - fusion Cloning反应混合物吗?
我们不推荐这个。将反应混合物转化为大于用户手册中所述的量可能对您的细胞有毒。对于融合克隆反应的转化,使用每50μl恒星态细胞的2.5μL未稀释的未稀释的反应混合物。
(任选)对于较大的转化体积,每100μl可转化5.0μL未稀释的未稀释的反应混合物恒星Comptent细胞.
在融合克隆反应中,阴性对照应该有多少菌落?
试剂盒提供的阴性对照通常产生少于5%的蓝色菌落;产生的白色菌落的数量因菌株的不同而略有不同。一般来说,实验底片上的白色菌落中只有不到5%含有背景。我们观察到,实验平板上的菌落有95%以上是正确的。这说明了In - Fusion技术的高水平克隆效率,即,不管存在的转化菌落总数如何,正确菌落恢复的百分比。
我可以使用电穿孔来改变融合克隆反应混合物吗?
1:5稀释的In - Fusion Cloning反应混合液1µl可电切成50µl的electrocompetent细菌细胞.
如何保证转化效率和整体克隆效率?
融合克隆是一体的一体化解决方案,可以保持高变换效率,并且还提供了最高水平的克隆效率。虽然高转化效率允许大量转化的菌落,但高克隆效率与准确性言论,确保超过95%的转化体是正确的,因此降低筛分菌落所需的时间量。
- 引物必须是高质量的,以确保同源区域的序列是正确的,以使克隆反应有效和准确地进行。
- 干净的PCR片段是成功克隆的关键。我们推荐核旋蛋白凝胶和PCR清理用于您的净化,它包含在一些in - Fusion Snap Assembly包中。
- 为了克隆效率,重要的是在扩增后从DNTPS和PCR引物纯化PCR片段。
- 使用高度胜任的大肠杆菌转化效率大于10的细胞8cfu /µg超螺旋DNA。大多数自制的感受性电池的感受性都不够强,尤其是在使用前将这些电池储存起来。我们推荐恒星主管细胞,优化后可用于融合克隆,并包含在所有捆绑包中。
提示:
一般资料
计划你的实验
成功的融合克隆反应需要在克隆插入物和线性化载体的末端有15 bp的同源重叠,如果多个插入物要同时连接,则需要相邻插入物。我们建议将同源性重叠增加到20 bp进行多插入克隆。
- 这些重叠可以通过PCR扩增或寡核苷酸合成产生任何克隆片段来产生。
- 不推荐短于12nt或长于21nt的同源重叠。
- 可以通过在嵌件特异性序列和同源重叠之间添加核苷酸来调节融合构建体的平移读取框连续性。
- 互补区域必须位于相邻DNA片段的末端,否则它们将不会被融合克隆连接起来。
融合酶混合物中的3'核酸外切酶在克隆插入物和线性化载体的末端产生单链5'悬挑。这些悬挑在互补位点处退火,重组圆形结构物在融合过程中被拯救大肠杆菌.
- 我们不推荐使用能力小于10的单元格8cfu /µg超螺旋DNA。
- 融合克隆不允许线性DNA分子的共价组装。
选择工具包格式
融合扣套装主混合物可用冻干(EcoDry)或者液体格式。每种格式还包含用于对照实验的试剂(线性化载体,2 kb插入)。
在决定工具包格式时,需要做出两个决定。首先,您想要冻干或液体试剂盒格式,其次,您是否对其他产品感兴趣以提高克隆效率(星形活性细胞、PCR产品纯化试剂盒和PCR酶)?下表说明了冻干试剂盒和液体试剂盒格式之间的差异。
冻干与液体试剂盒格式 | ||
---|---|---|
功能 | In - Fusion Snap Assembly EcoDry | 内熔合卡扣组件(液体) |
预先报价,冻干的成分,最大限度地减少处理错误 | ![]() |
|
室温储存,节省冷冻空间,消除冻融循环 | ![]() |
|
定制能力:反应量和/或塑料制品 | ![]() |
|
15分钟的反应时间 | ![]() |
![]() |
向量
兼容向量
任何线性载体可用于融合克隆,无论大小、组成或可用的限制位点。在克隆反应之后,在大肠杆菌,但请注意,圆形载体与克隆反应本身并不兼容。此外,融合克隆不允许共价键连接的线性DNA分子的组装。
向量的大小
In - Fusion技术允许在一次反应中简单地将单个或多个DNA片段直接克隆到大型载体(例如32.6-36 kb的腺病毒载体,46 kb的cosmids *),而无需将中间克隆到转移/穿梭载体。(请参见图1,2,5和表IIIAdeno-X腺病毒系统3小册子详情请参阅。)
*由融合克隆组装的46kb粘性载体在化学态态细菌中转化,从而允许重组载体的救援。它不用于实际的粘性包装反应。
向量线性化和纯化
线性化的选项包括:
- 限制摘要包含一个或多个限制性内切酶.
- 为了高效的融合克隆,线性化载体末端的完整性是至关重要的。我们建议使用高质量的限制性内切酶,进行数小时的消化。然而,夜间限制消化是不可取的。
- 载体末端不需要去磷酸化;该载体不会在融合克隆反应混合中再循环,除非它在其末端携带15 nt互补重叠。
- 通过限制性消化线性化的载体应通过制备琼脂糖凝胶电泳(用铝箔覆盖以防止DNA损伤)纯化。电泳应在低电压下进行,以确保线性和圆形(未切割)矢量分子的分离。
- 将引物定位在所需的克隆位点进行反PCR。
- 克隆位点的选择是灵活的,因为不需要适当的限制位点。
- 同时PCR介导的突变(缺失、插入、碱基改变)是可能的。
- 可以将15-BP同源重叠添加到PCR线性化载体上而不是插入物中。
- 通过使用具有高校对活性的PCR聚合酶来保持载体主干的完整性,如PrimeSTAR Max DNA聚合酶(与一些In - Fusion Snap Assembly捆绑提供).这种聚合酶是高度健壮和准确的,可扩增到6 kb的人类基因组DNA, 10 kb的大肠杆菌基因组DNA和15 kb的lambda DNA。它与两步或三步PCR循环兼容,并且在富含gc的模板上显示最小的错误率。
- 通过反向PCR线性化的载体应使用克隆增强剂(CE)破坏亲代质粒。经过ce处理的PCR线性化的载体可能需要琼脂糖凝胶电泳进一步纯化,如果线性化的载体prep中存在PCR副产物。
插入
插入来源
以下类型的插入件与融合克隆兼容:
- pcr扩增的DNA片段,带有与相邻DNA片段末端的悬垂互补,合成寡核苷酸,或线性载体。
- 用一个或多个限制性消化产生的DNA片段限制性内切酶. 在这种情况下,所需的15 bp同源性必须由相邻的DNA片段、合成寡核苷酸或线性载体携带。
- 合成寡核苷酸(≥50bp),与相邻碎片的末端或线性化载体的15-bp同源性。通过脱盐纯化的高质量、非磷酸化寡核苷酸与In - Fusion克隆兼容。不需要凝胶或高效液相色谱纯化寡核苷酸。
大的插入
用于克隆大碎片的融合技术已经优化。使用融合克隆已经成功地克隆到PUC19中的DNA插入物。
![大片段DNA融合克隆成功率高](http://www.yamajr.com/learning-centers/cloning/images/200-Cloning/CC-TechFigs/InFusion-FAQ-B19_1882_T.gif)
克隆15kb大小的片段时,十个克隆中有十个包含正确的插入片段(克隆效率100%)(克隆PCR筛选结果证实)。
小插入物
用In - Fusion克隆成功克隆的最小插入片段是一个50 bp的合成寡核苷酸(包括两个与载体末端重叠的15 nt同源序列)。
对于短合成寡聚体(50 - 150 bp)的In - Fusion克隆,建议寡聚体与载体的摩尔比为5-15:1。根据寡聚体长度的不同,最佳比例必须由经验来确定。
注意:非磷酸化寡核苷酸与In - Fusion克隆兼容。然而,in - Fusion酶混合中的3'外切酶活性需要末端3' OH基团。
多个插入
我们已经成功地测试了多片段克隆多达5插入。(克隆示意图和菌落筛选结果分别见下图和表)
多片段克隆的引物设计可以通过我们的在线引物设计工具(Primer Design Tool兼容Mozilla Firefox或谷歌Chrome浏览器,但不兼容Internet Explorer)。
请注意,在两个相邻片段之间,In - Fusion反应只需要一个同源重叠。这个重叠可以位于任何一个片段上。
融合克隆具有在单一反应中克隆多个片段的改进能力。使用这个系统,同时克隆多达4个1-kb的片段就像克隆单个片段一样容易。这将节省数周的时间,否则将花在筛选克隆和亚克隆。
插入 | 菌落筛选 | |
---|---|---|
碎片 | 殖民地,1/5镀 | 正确的克隆 |
1KB+1KB | 2,128 | 10/10 |
1 kb + 1 kb + 1 kb | 83 | 7/10 |
1kb + 1kb + 1kb + 1kb | 31 | 8/10 |
1kb + 1kb + 1kb + 1kb + 1kb | 14. | 4/10 |
引物设计
与融合克隆相容的PCR引物
每个正向(5'→3'意义链)和反向(5'→3'反义链)In - Fusion Cloning PCR引物应包括以下内容:
- 模板特异性(基因特异性)部分在其3'端。为保证PCR扩增的特异性和有效性,引物的模板特异性部分长度应为18-25 nt。
- 引物5'端的15 nt同源性,与线性化载体或相邻插入物的末端互补(如果同时克隆多个插入物)。不推荐短于12NT和长于21NT的同源重叠。15个碱基的互补区必须位于相邻DNA片段的末端,否则不能通过融合克隆连接。
- 我们建议将多插入克隆的同源性增加到20bp。
- 当载体通过限制性摘要线性化时,限制性位点的5'突出包括在10nt的同源中,而限制性位点的3'突出被排除在同源的15 nT的计数之外。
- (可选)为确保翻译阅读框的连续性,或保留限制性位点,可在模板特异性部分和15 nt同源重叠部分之间添加额外的核苷酸到PCR引物中。
产生DNA片段的同源重叠
克隆端部之间15 bp的同源重叠有助于所有In - Fusion克隆反应。它们可以通过以下方式生成:
- 使用带有与线性化载体或相邻插入物末端同源的15个nt 5'悬挑的PCR引物对克隆插入物进行PCR扩增
- 目的载体的PCR线性化,使用PCR引物携带与克隆插入物同源的15 nt 5'悬垂物
- 合成寡核苷酸,生成15 nt 5'端伸出与末端同源的线性化向量或相邻插入向量。通过脱盐纯化的高质量、非磷酸化寡核苷酸与In - Fusion克隆兼容。不需要凝胶或高效液相色谱纯化寡核苷酸。
引物设计工具
In - Fusion PCR引物的设计说明包含在所有In - Fusion克隆用户手册中。还可以使用一些工具来帮助处理这个过程。
- 我们的网上引物设计工具有利于In - Fusion克隆的初级设计,并兼容Mozilla Firefox或谷歌Chrome浏览器。(Internet Explorer与Primer设计工具不兼容。)支持的克隆条件如下:
- 单片段克隆
- Multiple-fragment克隆
- 由限制摘要线性化的向量
- 反PCR线性化的载体
- Prelinearized向量
- 由用户设计的嵌入式专用引物
- 插入由引物设计工具生成的特定引物
- 目前版本的Primer Design Tool不允许对翻译阅读框架的连续性进行调整,这应该由用户手动设计。
- 我们还建议SnapGene查看器作为一个有用的,免费的在线工具在网上组装重组结构,人工设计In - Fusion PCR引物,调整翻译阅读框的连续性。
杂项选择
限制酶位点保存
引物设计让你很容易保存或消除限制位点用于线性化克隆载体。为了维持克隆连接处的限制性位点,可以在模板特异性部分和15 nt同源重叠部分之间的PCR引物中添加核苷酸。
在线引物设计工具提供了保留限制站点的选项(Primer Design Tool兼容Mozilla Firefox和谷歌Chrome浏览器,但不兼容Internet Explorer)。
翻译阅读框架
融合克隆使您能够在与所需标签(如荧光蛋白、Myc、HA等)相同的翻译阅读框中无缝克隆感兴趣的基因。融合PCR引物设计中的细节有助于此应用,使您能够在重组载体中保持阅读框的连续性。以下是两种选择:
- 调整In - Fusion PCR引物的模板特异性(基因特异性)部分的长度
- 在In - Fusion PCR引物的模板特异性部分和15 nt同源重叠部分之间添加核苷酸
请注意,我们的在线初级设计工具的当前版本不允许调整翻译阅读框架的连续性。引物顺序由用户手工设计。我们推荐SnapGene查看器作为一个有用的,免费的在线工具来帮助完成这个任务。
插入外部核苷酸序列
可以在模板/基因特异性部分和融合PCR引物的融合PCR引物的15-NT同源重叠之间加入小外部核苷酸序列(例如,小标签,Kozak序列,限制性位点,切割位点等。
分离15-nt同源重叠
同源的15-nt重叠可以在两个相邻的DNA片段之间分裂。只有通过反PCR将载体线性化,它才能在插入物和载体之间分离。
此选项的底漆设计不方便在线底漆设计工具。我们推荐SnapGene查看器作为有用的免费在线工具来帮助解决此任务。下面的图表显示了融合引物设计和互补股的退火,使用片段1(红色)和片段2(蓝色)之间的15-NT重叠分开:
定点诱变
融合克隆允许单个或多个碱基的改变、删除和插入。详情请参阅我们的突变与融合克隆技术笔记.
一般的指导方针
摩尔比
融合克隆使用一种非常强健的酶,在大多数情况下都可以进行高效克隆。关于插入/载体数量的一般性建议包含在所有当前的融合内克隆用户手册中。
- 为了确保在标准条件下或在执行单片段或多片段克隆时获得最佳结果,请使用2:1的插入与向量比率。
- 对于线性化,纯化的载体,每个刀片中的每一个的摩尔比应为2:1。具有一个载体的两种插入件的摩尔比应为2:2:1。
- 计算所需数量的每个DNA片段,使用不少于20 ng最小的插入和计算剩余的碎片的数量因此,维护2:1 insert-to-vector摩尔比率(每个插入应该计算在2:1的摩尔比率对向量)。
- 对于小片段(150 ~ 350 bp)的克隆,建议插入-载体摩尔比为3-5:1。
- 对于合成短寡聚体(50 ~ 150 bp)的克隆,建议寡聚体与载体的摩尔比为5-15:1。根据寡聚物的长度,最佳的摩尔比必须由经验来确定。
- 非磷酸化寡核苷酸与In - Fusion克隆兼容。然而,in - Fusion酶混合中的3'外切酶活性需要末端3' OH基团。
使用我们的在线摩尔比计算器根据摩尔比、插入长度(bp)和向量长度(bp)计算具体的插入到向量的数量。
控制反应
始终使用在每个套件中提供的控制载体(线性化PUC19)和控制插入物进行控制内融合反应。如果您的实验产生了意外结果,则控制反应可以帮助您确定开始故障排除的位置。
试剂盒提供的阴性对照通常产生少于5%的蓝色菌落;产生的白色菌落的数量根据用于转化的菌株略有不同。一般来说,实验板上少于5%的白色菌落含有背景。我们观察到≥实验板上95%的菌落是正确的。这说明了融合技术的高克隆效率(即,无论存在的转化菌落总数如何,恢复的正确菌落百分比)。
培养时间
建议不要增加融合反应时间。它可以在克隆插入件和载体的末端产生不均匀的单链区域,导致同源重叠的低效退火,从而降低了克隆效率。
同源重叠的位置
同源15 bp重叠应精确定位在载体末端并插入。不位于相邻DNA片段末端的15 bp互补区不会通过融合克隆连接。载体的PCR线性化允许引物定位在所需的克隆位点,而不管可用的限制条件如何离子位点,从而能够在特定位置的末端产生15 bp的重叠。
同源重叠的长度
电流内融合克隆反应条件优先于单插入或多插入克隆的15bp或20-bp同源重叠。我们不建议使用短于12bp或长于21bp的重叠。
PCR要求
兼容的聚合酶
融合克隆与任何PCR聚合酶兼容。3'悬垂不干扰克隆反应。
为了确保无差错的插入,请使用具有高校对活动的聚合酶,如PrimeStar Max DNA聚合酶(与一些In-Fusion Snap Assembly包一起提供)。这种聚合酶是高度健壮和准确的,可扩增到6 kb的人类基因组DNA, 10 kb的大肠杆菌基因组DNA和15 kb的lambda DNA。它与两步或三步PCR循环兼容,并且在富含gc的模板上显示最小的错误率。
融合PCR引物扩增提示
- In - Fusion PCR引物的模板特异性3'端长度应为18-25 nt,以确保模板扩增。
- 确定t米对于融合PCR引物,使用独立软件进行PCR引物分析,如IDT Technologies的OligoAnalyzer 3.1.使用标准的毫克2+, Na+, dNTP浓度通常推荐用于PCR。
- 为了获得最佳扩增,使用与In - Fusion PCR引物的3'模板特异性部分兼容的退火温度,执行最初的3 - 5个PCR循环。其余的PCR循环应使用与T相容的退火温度米整个引物。
- 如果你经历了低效的PCR扩增,可能有必要重新设计In - Fusion PCR引物,通过延长或重新定位模板特异性3'端。
PCR要求
PCR扩增的DNA必须在融合克隆反应之前进行纯化。这可以通过以下选项之一实现:
- 核自旋凝胶和PCR净化
- 凝胶提取能够从背景PCR副产物或其他污染物中选择所需大小的特定DNA片段。
- 如果PCR不能产生背景涂片,则柱纯化是适当的。
- 克隆增强器(CE)
- 这种专有的酶混合去除背景质粒DNA和PCR残留。
- CE适用于产生预期大小的单个片段而不需要背景涂片的PCR。
- CE是高通量(HTP)应用的一个方便工具,它采用高度优化的PCR循环条件和引物,生成预期大小的干净DNA片段。
注意:在大多数情况下,CE处理不需要额外的柱净化或凝胶萃取。然而,为了确保更好的克隆结果,PCR线性化载体可能需要结合CE处理,然后凝胶提取,从可能的PCR副产物中分离线性化载体。
转变大肠杆菌
细胞的能力
融合克隆需要具有胜能的细菌细胞不少于108cfu /µg超螺旋DNA。
- 我们推荐恒星主管细胞(包括在所有in - Fusion Snap Assembly包中)。任何通用的克隆大肠杆菌菌株也应与融合克隆相兼容。
- 星状活性细胞已被验证用于克隆和扩增大型载体(如BAC、FOSMID)和具有重复序列的载体,如逆转录病毒/慢病毒载体中的长末端重复序列(LTR),或腺病毒载体中的反向末端重复序列(ITR)。
- 前10名细胞或其衍生物(例如。,ccdB生存2 t1r大肠杆菌)和相关菌株(如DH10B、MC1061)在融合克隆中是次优的,导致重组克隆数量较低。如果您正在执行多个片段克隆,或使用低拷贝数向量,这可能特别关注。
不建议进行融合克隆
我们不建议将In - Fusion反应混合物转化为以下任何一种:
- 大肠杆菌菌株缺乏recA1或者恩达突变
- 大肠杆菌针对特定应用的菌株(例如,大规模的蛋白质表达)
- 革兰氏阳性菌株
- 细菌细胞携带n(敖)突变
注意:如果绝对有必要使用未经In - Fusion克隆验证的特定菌株,则将反应混合物稀释为1:5可能会提高转化效率。
前10名细胞或其衍生物(例如。,ccdB生存2 t1r大肠杆菌)和相关菌株(如DH10B、MC1061)在融合克隆中是次优的,导致重组克隆数量较低。如果您正在执行多个片段克隆,或使用低拷贝数向量,这可能特别关注。
最优转换数量
用于化学活性细菌细胞的转化(例如,恒星主管细胞),使用每50μl细胞的2.5μl未稀释的含有克隆反应混合物。
的转换electrocompetent细胞,每50µl细胞使用1µl 1:5稀释的In - Fusion Cloning反应混合液。
(可选)对于更大的转化体积,每100µl恒星感受态细胞可转化5.0µl的未稀释、未纯化的反应混合物。
我们建议不要将反应混合物的转化量大于上述量,因为它可能对您的细胞有毒。
矢量和与转换效率相关的插入物业
一些载体或插入物可能包含重复序列(例如,逆转录病毒或慢病毒LTR、腺病毒ITR等)。当使用这些载体时,可能需要优化细菌转化,以防止重组构建体内的重排,并在体外拯救和扩增期间增加其稳定性大肠杆菌.在25 - 30°C进行热休克,同时在120-160转/分钟的震动中复苏细菌,并改变选择抗生素浓度和/或培养皿转化培养物的生长温度(例如,25°C, 30°C等)。
选定的应用程序
用荧光蛋白在框架内克隆感兴趣的基因(简易方案)
- 使用易于融合的荧光蛋白载体.
- 根据以下资源设计In - Fusion PCR引物:pAcGFP1-N In - Fusion Ready矢量信息,pAcGFP1-C融合就绪向量信息,或在产品表的“详细信息”部分的“文档”中列出的矢量信息,用于在in - fusion Ready上列出给定的矢量绿色和红色的荧光蛋白载体产品页。
注意:为了保持翻译阅读框的连续性,如果你感兴趣的基因插入到荧光蛋白的上游,就不应该包含停止密码子。如果感兴趣的基因在荧光蛋白的下游,它可能保留自己的STOP密码子,但荧光蛋白不应该。 - 使用在步骤2中设计的融合PCR引物扩增您的利益基因。
- 使用纯化感兴趣的扩增基因核自旋凝胶和PCR净化或者克隆增强剂.
- 遵循In - Fusion Ready Vector Cloning Protocol-At-A-Glance用于融合反应和转化说明。
用荧光蛋白在框架中克隆感兴趣的基因(替代方案)
- 选择任何携带荧光蛋白的载体。通过限制性内切酶消化或反向PCR使载体线性化。
- 用凝胶萃取纯化线性化的载体,确保只分离线性载体分子。
- 使用在线PCR技术设计融合PCR引物引物设计工具. (Primer设计工具与Mozilla Firefox或Google Chrome web浏览器兼容,但与Internet Explorer不兼容。)
- 或者,In - Fusion引物设计的说明见本节融合卡套装用户手册和In - Fusion Snap Assembly EcoDry用户手册.
- 无论采用哪种设计方法,我们都推荐SnapGene查看器为了在网上重组结构的组装和In - Fusion引物在意义和反义链中的位置的容易可视化。
- 为了保持翻译阅读框的连续性,如果你感兴趣的基因插入到荧光蛋白的上游,就不应该包含停止密码子。如果感兴趣的基因在荧光蛋白的下游,它可能保留自己的STOP密码子,但荧光蛋白不应该。
- 如有必要,您还可以通过在融合PCR引物的模板/基因特异性部分与15-NT同源部分之间插入额外的核苷酸来调整读取框连续性,如下表所示。(当前我们的底漆设计工具的当前版本不允许此类调整,并要求用户手动设计。)
5' 15 nt与载体序列同源性 维持读框所需的基数 In - Fusion PCR引物的3'基因特异性序列 Gta TTC atc CGG CCG
0 Atg GGC CTT tac cca act CGC
g tat tca tcc ggc cg
1 Atg GGC CTT tac cca act CGC
Gt att cat CCG GCC g
2 Atg GGC CTT tac cca act CGC
- 使用在步骤3中设计的融合PCR引物扩增您的利益基因。
- 使用纯化感兴趣的扩增基因核自旋凝胶和PCR净化或者克隆增强剂.
- 遵循融合卡套装用户手册或者是In - Fusion Snap Assembly EcoDry用户手册用于融合反应和转化说明。
与大向量的相容性
In - Fusion技术允许在一次反应中简单地将单个或多个DNA片段直接克隆到大型载体(例如32.6-36 kb的腺病毒载体),而无需将中间克隆到转移/穿梭载体。见图1、2、5和表三Adeno-X腺病毒系统3小册子有关详细信息。
与大型刀片的兼容性
该技术已针对克隆大碎片进行了优化。使用融合克隆已经成功地克隆到PUC19中的DNA插入物。
![大DNA片段融合克隆成功率高](http://www.yamajr.com/learning-centers/cloning/images/200-Cloning/CC-TechFigs/InFusion-FAQ-B19_1882_T.gif)
克隆15kb大小的片段时,十个克隆中有十个包含正确的插入片段(克隆效率100%)(克隆PCR筛选结果证实)。
Multiple-fragment克隆
我们已经成功地测试了多片段克隆多达5插入。(克隆示意图和菌落筛选结果分别见下图和表)
多片段克隆的引物设计可以通过我们的在线引物设计工具. (Primer设计工具与Mozilla Firefox或Google Chrome web浏览器兼容,但与Internet Explorer不兼容。)
请注意,在两个相邻片段之间,In - Fusion反应只需要一个同源重叠。这种重叠可以位于任何一个片段上,也可以在它们之间分割。
![同源重叠有助于在单一反应中无缝克隆多个片段](http://www.yamajr.com/learning-centers/cloning/images/200-Cloning/CC-TechFigs/InFusion-FAQ-B16_2849_T.gif)
融合克隆具有在单一反应中克隆多个片段的改进能力。使用这个系统,同时克隆多达4个1-kb的片段就像克隆单个片段一样容易。这将节省数周的时间,否则将花在筛选克隆和亚克隆。
插入 | 菌落筛选 | |
---|---|---|
碎片 | 殖民地,1/5镀 | 正确的克隆 |
1KB+1KB | 2,128 | 10/10 |
1 kb + 1 kb + 1 kb | 83 | 7/10 |
1kb + 1kb + 1kb + 1kb | 31 | 8/10 |
1kb + 1kb + 1kb + 1kb + 1kb | 14. | 4/10 |
定点诱变
融合内克隆允许通过使用反向PCR进行单个或多个碱基改变、删除和插入。请注意,此应用程序依赖于高保真PCR。必须使用具有高校对活性的PCR聚合酶,例如PrimeSTAR Max DNA聚合酶.这种聚合酶是高度健壮和准确的,可扩增到6 kb的人类基因组DNA, 10 kb的大肠杆菌基因组DNA和15 kb的lambda DNA,并且在富含GC的模板上显示最小的错误率。
- 每个PCR引物在一个圆形载体模板上引导DNA合成方向相反。
- 正、反PCR引物的3'端为18-25 nt,与模板互补,确保高效特异性扩增。
- 突变包含在位于正向和反向PCR引物5'末端的同源15 nt重叠处(这种同源重叠是突变载体的再循环所必需的)。
- 单个或多个碱基的变化、缺失或插入可以在单个in - Fusion反应中引入。
- 还可以通过将正向和反向引物的3'端定位在缺失的边界位点,其中任一个引物的5'末端携带的同源突出,也可以通过将前向和反向引物的3'末端定位在较大的缺失。
- 由此产生的反PCR将生成一个5'和3'端互补的线性双链载体,并携带15 nt同源重叠(该重叠将通过In - Fusion反应和在内回收连接起来大肠杆菌,从而生成一个变异的载体)。
- 反PCR扩增的载体必须用克隆增强子处理,以破坏亲代载体。可能需要通过制备凝胶电泳进行额外的纯化,以确保从PCR副产物和亲代圆形载体的可能残留中分离线性化的载体。
欲知更多详情,请参阅我们的突变与融合克隆技术笔记。
克隆shRNA(小发夹RNA)
通过In - Fusion技术,可将shRNA双链DNA寡核苷酸(≥50 bp)克隆到线性化的shRNA表达载体中。
- 对于短合成寡聚体(50 - 150 bp)的In - Fusion克隆,建议寡聚体与载体的摩尔比为5-15:1。根据寡聚体的长度,最佳比例必须由经验来确定。
- 通过脱盐纯化的高质量非磷酸化寡核苷酸与融合克隆兼容。然而,融合酶混合物中的3'核酸外切酶活性需要末端3'OH基团。
注意:并非所有为直接细胞转染的所有反义寡核苷酸,例如siRNA,当从载体中表达为shRNA时,同样有效。通常建议将siRNA寡核苷酸重新设计为表达作为靶序列的各种取向作为靶向或反义链的shRNA。
- 为了有效的敲除,在建立稳定的细胞系或运行之前,通常首先设计和测试四种不同的shRNA结构(使用易于转染的细胞,如果适用)体内实验。
- 为了区分重组ShRNA载体,可以将诊断限制性位点(MLUI)插入来自RNA聚合酶III终止信号的下游的SHRNA寡核苷酸中。
克隆microRNA (miRNA)前体
- MicroRNA前体和侧翼基因组DNA的序列可以从许多公共数据库获得,包括基因库和EMBL-Bank.的UCSC基因组生物信息学网站拥有一个易于导航的基因组数据库,跟踪miRNA。桑格研究所主办miRBase,汇编已知的miRNA序列。
- 从基因组DNA中扩增出100–300 bp的miRNA前体侧翼DNA,用于克隆到荧光蛋白的3'UTR中,该荧光蛋白由miRNA表达载体携带。侧翼DNA确保了Drosha的高效处理。
- 对于融合克隆,MiRNA前体(100-300bp)被扩增,其掺入与miRNA表达载体的末端同源的15bp突出物。载体应在荧光蛋白的3'UTR处线性化。克隆反应的建议的miRNA前体 - 载体摩尔比为3-5:1,取决于前体长度。必须凭经验确定最佳摩尔比。
- 在细胞中,miRNA前体与荧光蛋白共同表达(如图2所示)技术报告),允许下列两种情况:
- 荧光蛋白的表达,导致荧光细胞标记。
- miRNA前体加工,导致荧光标记的细胞中的靶向基因敲低。
- 我们提供tet诱导miRNA表达系统和载体用红色或绿色荧光蛋白标记。
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