单克隆抗体已被广泛用于各种研究和诊断目的,严格的抗原特异性是一个关键的兴趣点。此外,由于抗体工程(例如,嵌合抗体和人源抗体的发展)和抗体生产技术的改进,直接使用单克隆抗体作为治疗方法变得更加可行。
由于抗体-抗原特异性是由抗体可变区的特定结构决定的,因此分析该区域的序列是许多应用的第一步,包括在无动物系统中生产抗体,将抗体作为药物开发,以及生产工程抗体变体。利用SMART cDNA合成技术和一种简化的方法,聪明的比赛用品提供了一种快速、简单的方法来分析这些可变和重要的核苷酸序列。
介绍
后果
变量域序列分析的解
免疫系统产生108各种抗体抵御外界物质的入侵。这种多样性是通过在发育中的淋巴细胞中发生的V(D)J重组实现的。抗体分子具有重(H)链和轻(L)链组成,具有常量和可变(V)链;V(D)J重组是将可变序列与其他基因片段进行近乎随机的重排。这个过程产生独特的抗原受体。由于H和L链的n端是决定抗体-抗原亲和力的可变区域,因此对该区域的分析非常有意义。
![抗体的结构](http://www.yamajr.com/learning-centers/cdna-synthesis/images/150-cDNA_Synthesis/CC-TechFigs/RACE_TN01_113792.gif)
图1所示。基本的抗体结构。
在分析可变区时,设计通用的引物来扩增所有可能的抗体序列是非常困难的。H和L链上游5 '端固有的变异性导致低序列同源性。分析这些可变区域的有效方法是在可变区域下游的固定区域设计一个简并引物,该区域的序列相对保守。然后可以使用5 ' RACE (R阿皮德一个mplification的cDNAENds)方法,然后进行排序。智能RACE套件带来完整的5 '端信息和敏感性的这一过程。
智能技术在RACE应用中的优势
使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit,在反转录时将SMARTer II A寡核苷酸添加到cDNA的末端。这个过程包含了我们独特的SMART (年代有魅力的米助力一个t的5′端RNAT该技术允许逆转录酶到达转录本的绝对5 '末端。大多数其他RACE-PCR方法不能捕获5 '端,因此错过了重要的信息。此外,在5 '端添加SMART序列,可以利用该位点进行下游扩增和克隆。对SMARTer RACE组件和协议的优化,大大减少了非特异性背景,提高了放大效率。即使是被基因组DNA污染的样品,该稳健的系统也能产生可靠的结果,适用于广泛的应用。用高保真聚合酶扩增cDNA片段,确保了有效分析所需的核苷酸序列的准确复制。
小鼠杂交瘤抗体基因的快速克隆
在准备克隆小鼠杂交瘤抗体基因时,根据NCBI核苷酸数据库中登记的所有小鼠IgG类序列,为H、L(κ)或L(λ)链设计了逆转录引物(RT引物)和RACE PCR反向引物(5′-RACE引物)。通过使用SMARTer RACE方法从总RNA中进行第一链cDNA合成,然后直接进行5′-RACE PCR,不仅可以获得5′-末端序列,还可以获得包含可变区全长序列的cDNA片段。
图2。使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit对抗体可变域进行5 ' -RACE PCR的实验流程。
培养小鼠杂交瘤株,并确认其产生的单克隆抗体具有分别由γ2a和κ链组成的H链和L链。制备总RNA,并将其用作SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒的输入。根据两种t重链(H)和轻链(L)以及扩增产物通过部分反应混合物的琼脂糖凝胶电泳得到证实。
图3.确认从小鼠杂交瘤成功扩增抗体基因。
扩增产物克隆到pUC118中并进行测序。通过分析单克隆抗体n端氨基酸序列,确认序列中含有与H链和L链氨基酸序列相对应的ORFs。
然后,我们对另外6株杂交瘤菌株的可变抗体区进行了相同类型的基因序列分析。所有抗体亚类均获得PCR产物。序列分析表明,90%的h -链克隆和50%的l -链克隆准确编码了各自目标抗体蛋白的n端氨基酸序列。
图4。小鼠抗体基因不同亚类的扩增.
在少数情况下,克隆与目标抗体具有序列同源性,但编码ORF的克隆由于其序列中存在终止密码子而不太可能编码功能性抗体。此外,我们怀疑一个特定克隆含有用于细胞融合的骨髓瘤细胞的转录本,因为该序列是从多发性杂交瘤中获得的。一些杂交瘤产生的克隆比目标单克隆抗体的序列编码更多。基于这些结果,很明显,目标抗体的N端氨基酸序列应与DNA序列分析同时进行分析和确认。
对SMARTer RACE cDNA合成的进一步改进,包括流线型克隆
为了加强RACE程序,我们最近对SMARTer RACE套件进行了重大更新。以上数据由SMARTer RACE cDNA Amplification Kit、PrimeSTAR HS DNA Polymerase进行PCR、Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End)进行连接克隆获得。从那时起,我们发展了智能赛车5′/3′套件,一个具有相同独特智能核心技术的完整系统,以及进一步细化在反应条件和下游克隆。
新的试剂盒包含进行更聪明的种族实验所需的所有成分(除了基因特异性引物)。通过将SMARTer II A寡核苷酸与SMARTScribe逆转录酶配对,它提供了高灵敏度和特异性以及低背景。SeqAmp DNA聚合酶提供了稳健的PCR性能,在扩增具有挑战性的长靶点或富含GC的靶点时尤其有用。
smart RACE 5 ' /3 '套件的关键组件是融合HD克隆试剂盒,它允许简单,准确克隆你的5 ' -RACE片段,而不使用连接酶。该试剂盒提供了与in - fusion技术兼容的线性化载体,所含引物是专门为匹配该载体而设计的。融合克隆方法是高效的,适合所有克隆应用程序。通过将这项技术与成熟的SMARTer RACE方法配对,从RNA到准备进行分析的克隆只需要两天时间。
结论
SMARTer RACE cDNA合成为抗体可变域的全长序列分析提供了一种敏感的、流线型的解决方案。这些可变区域的多样性,虽然对有效的免疫反应至关重要,但对研究人员提出了一个挑战,希望分析这些基因片段进行广泛的研究,包括药物开发。有了这个序列,就有可能改良抗体在活的有机体内稳定性,具有改善的亲和力,或具有双重特异性。评估抗体可变区是这些和许多其他抗体修饰的第一步,而SMARTer 5 ' -RACE PCR是克隆这些目标进行测序的有效方法。
方法
培养七种小鼠杂交瘤菌株(均储存在Takara Bio Inc.)中的每一种,并通过亚类试验确认,以产生分别由γ2a和κ或λ链组成的H链和L链的单克隆抗体。从10个样品中制备总RNA6用FastPure RNA试剂盒检测细胞(10厘米培养皿),得到约70µg。
根据NCBI核苷酸数据库中登记的所有小鼠IgG类序列,为H、L(κ)或L(λ)链设计了一个反转录(RT)引物和一个用于RACE PCR的反转录引物(5′-RACE引物)。按照SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒的方案,使用500 ng总RNA作为模板合成第一链cDNA。对于每个样本,分别使用H链和L链的RT引物,同时进行两个逆转录反应。
1µl | 总RNA (500 ng/µl) | |
1µl | RT引物(12pmol /µl) | |
1.75微升 | 去离子氢2O | |
3.75µl | 总计 |
将这些反应混合物在72°C下孵育3分钟,然后在42°C下孵育2分钟,以使RNA变性。然后加入SMARTer II A olignucleotide(12µM) 1µl,混合,总体积为4.75µl。每一个cDNA合成反应均得到Master Mix(如下图所示)。
2µl | 5 x第一链缓冲区 | |
1µl | 德勤(20毫米) | |
1µl | dNTP混合料(10毫米) | |
0.25µl | RNase Inhibitor (40 U/µl) | |
1µl | SMARTScribe逆转录酶(100 U/µl) | |
5.25微升 | 总计 |
向每个反应中添加5.25µl主混合物,共10µl。在42°C下进行第一链cDNA合成90分钟,然后在72°C下进行10分钟。向每个反应中添加50µl Tricine EDTA缓冲液1,并在-20°C下储存样品,直到进行RACE反应。5′-RACE-PCR采用PCR方法PrimeSTAR HS DNA聚合酶以上面生成的第一链cDNA为模板。增加的组件如下:
10微升 | 5倍PrimeSTAR缓冲液(Mg2+) | |
4µl | dNTP混合物(2.5 mM) | |
2.5微升 | 第一链cDNA | |
5µl | 10X UPM(通用Primer A Mix) | |
1µl | 5′-RACE底漆(10 pmol/µl) | |
0.5微升 | PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5 U/µl) | |
27µl | H2O | |
50微升 | >总数 |
热循环程序设置如下:
94°C | 10秒 | ||
30个周期 | |||
98°C | 10秒 | ||
60°C | 5秒 | ||
72摄氏度 | 1分钟 | ||
72摄氏度 | 3分钟 |
通过琼脂糖凝胶电泳(使用2%NuSieve 3:1琼脂糖)在部分反应混合物上确认来自5′-RACE PCR的扩增产物强力克隆试剂套装(钝端)并通过桑格测序进行分析。以上实验是用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit和其他一些产品进行的。smart RACE 5 ' /3 '试剂盒包含RACE PCR的所有必要成分:
智能RACE 5'/3'套件组件 | |||||
---|---|---|---|---|---|
cDNA第一链合成试剂 | 更智能的第一链合成试剂,5 ' -和3 ' - race PCR通用引物组合,对照RNA和引物(引物已经过修改,可用于本试剂盒) | ||||
DNA聚合酶 | SeqAmp DNA聚合酶 | ||||
在融合克隆试剂 | 线性化pRACE载体,在Fusion HD克隆试剂盒中(在Fusion HD酶预混料中,线性化pUC19控制载体,控制插入物) | ||||
主管细胞 | 星状主管细胞 | ||||
PCR凝胶提取试剂盒 | 核酸旋蛋白凝胶和PCR清理试剂盒 |
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