该ICELL8 CX单细胞系统协议允许产生足以用于单核测序的核准备。我们的核隔离方案已被验证用于悬架(K-562,Jurkat和Gm12878)和粘附(ES,NIH 3T3和HEK293T)细胞系。GydF4y2Ba
用户协议GydF4y2Ba
协议:哺乳动物细胞的核分离GydF4y2Ba
介绍GydF4y2Ba
协议GydF4y2Ba
A.隔离前GydF4y2Ba
- 如下制备10ml核分离裂解试剂(NILR),并在4℃下储存:GydF4y2Ba
100.0µlGydF4y2Ba Tris-HCl,pH 7.5(1米)GydF4y2Ba 33.3µlGydF4y2Ba 氯化钠(3米)GydF4y2Ba 30.0µlGydF4y2Ba MgClGydF4y2Ba2GydF4y2Ba(1米)GydF4y2Ba 100.0µlGydF4y2Ba TERGITOL溶液(10%)(Millipore-Sigma, Cat。# np40s - 100毫升)GydF4y2Ba 达到9736µlGydF4y2Ba HGydF4y2Ba2GydF4y2BaO(分子生物学职系)GydF4y2Ba 10.0毫升GydF4y2Ba 总体积GydF4y2Ba 注意:GydF4y2BaTERGITOL是GydF4y2Ba高度GydF4y2Ba粘稠的,所以您可能希望使用正位移移液器,以确保移液准确。TERGITOL需要一些时间来解决;不要旋涡加速这一过程,因为这会导致NILR产生大量泡沫。GydF4y2Ba
- 从大约1 × 10开始GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba将Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)染料按1:1混合,每1ml细胞加入每种染料80µl(共160µl)。在使用前要避免光线照射。GydF4y2Ba
B.染色计数GydF4y2Ba
注意:GydF4y2Ba下面给出的方案样本量为2毫升,但可以根据您的实验需要进行放大或缩小。本节中的所有孵育步骤均可在4°C或4°C条件下进行GydF4y2Ba或GydF4y2Ba37°C,取决于您的细胞系/偏好。GydF4y2Ba
- 如果您使用的是悬浮细胞,请跳过步骤B.3。GydF4y2Ba
- 如果你使用贴壁细胞,你可以执行GydF4y2Ba以下之一GydF4y2Ba在进行第b.3步之前:GydF4y2Ba
- 从它们的支持/盘(例如,通过胰蛋白酶化)来分离细胞,添加完整的培养基以使胰蛋白酶灭活,用大胆管尖端轻轻地移液,以分解细胞丛,然后进入步骤B.3和B.4,GydF4y2Ba或GydF4y2Ba
- 染色细胞(在完全培养基中)直接在孔中任意4°CGydF4y2Ba或GydF4y2Ba37℃,用1x PBS洗涤,然后进行胰蛋白酶化,添加完整的介质,移液,并进入步骤B.5。GydF4y2Ba
- 将〜2.1ml培养基中的细胞悬浮液转移到新鲜的5ml锥形eppendorf管中。使用Moxi Z自动电池计数器和Moxi盒测定细胞浓度(参见Moxi Z用户手册,用于选择所分析的细胞的适当盒尺寸的指导)。确保小区尺寸门捕获正确的尺寸范围,或者产生的单元计数可能不准确。记录细胞浓度GydF4y2Ba和GydF4y2Ba细胞大小分布。GydF4y2Ba
- 将320μl预混合的Hoechst 33342和PI染料混合在剩余的细胞悬浮液中。通过将管反转5次轻轻混合。做GydF4y2Ba不GydF4y2Ba漩涡或过度搅动细胞。GydF4y2Ba
- 4°C孵育细胞GydF4y2Ba或GydF4y2Ba在此期间,将1X PBS预热至37°C。GydF4y2Ba
- 将2ml预温的1X PBS加入染色细胞中。轻轻翻转管子5次。做GydF4y2Ba不GydF4y2Ba漩涡或过度搅动细胞。GydF4y2Ba
- 通过在300℃下离心,将细胞沉积在5ml圆锥形eppendorf管中GydF4y2BaGGydF4y2Ba在4°C或5分钟GydF4y2Ba或GydF4y2Ba室温。你会看到一团坚硬的细胞。GydF4y2Ba
c分离核GydF4y2Ba
- 将颗粒从步骤B.7中重新悬浮在1mL NILR中(在步骤a.1中制备)。混合良好,使均匀混合物。GydF4y2Ba
注意:GydF4y2Ba如果您使用的细胞类型尚未通过本协议验证,则您的样本在此步骤可能需要一个潜伏期。GydF4y2Ba
- 300离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba在室温或4°C条件下,按特定细胞类型工作的推荐指南进行10分钟。GydF4y2Ba
- 去除并丢弃上清液。GydF4y2Ba
- 用1X PBS重新悬浮颗粒,反复用力移液,使团块分离。我们建议以1毫升的容量重悬细胞,但您的重悬容量可能取决于您想要的末端浓度。GydF4y2Ba
- 使用Moxi Z自动细胞计数器,获取细胞大小分布和细胞荧光的两个读数,并将读数平均值。记录细胞大小分布和Hoechst 33342/PI荧光强度。GydF4y2Ba
注意:GydF4y2Ba确保单元格大小门捕获正确的单元格大小范围,否则生成的单元格数可能不准确。GydF4y2Ba
- 比较整个细胞和细胞核的大小分布(见样本数据图)。细胞核的大小可能明显小于完整细胞的大小(在某些情况下,GydF4y2Ba是整个细胞大小的1 / 3到1 / 2)。GydF4y2Ba
注意:GydF4y2Ba细胞核产率通常为起始细胞数的~60%。根据使用的细胞类型,您的结果可能会有所不同。GydF4y2Ba
样本数据GydF4y2Ba
悬液和贴壁细胞系全细胞与细胞核大小分布的比较。GydF4y2Ba从三种悬浮液(GydF4y2Ba板一个GydF4y2Ba)及三附属物(GydF4y2Ba面板BGydF4y2Ba)细胞系在裂解之前(全细胞)和裂解后(核)。测试的所有样品显示出裂解后尺寸的标记减少,与核的回收一致。GydF4y2Ba
![用户协议GydF4y2Ba](http://www.yamajr.com/images/900-Special_Topics/902-OEM/AA-EyeCandy/researcher-inspecting-pipette-3175-iE.jpg)
用户协议GydF4y2Ba
用户生成的协议基于内部概念验证实验、客户协作和已发表的文献。在某些情况下,相关结果将在我们的GydF4y2Ba研究新闻BioView博客文章GydF4y2Ba.虽然我们希望这些协议能够在您的手中获得成功,但它们可能没有得到充分的审查或优化。我们鼓励您联系我们或参考已发表的文献,以获得关于这些用户生成和报告的协议的更多信息。GydF4y2Ba
如果您正在寻找特定于产品的、完全优化的用户手册或协议一览,请访问该产品的产品页面,在价格表中打开该产品的产品详细信息行,然后单击文档。有关查找文件的更详细说明,请参阅我们的GydF4y2Ba网站的faq页面。GydF4y2Ba
问题吗?你想分享一下你自己的协议吗?GydF4y2Ba
联系技术支持manbetx曼联GydF4y2Ba 提供反馈GydF4y2Ba万博体育投注manbetx登录
美国/加拿大:+1.800.662.2566•亚太地区:+1.650.919.7300•欧洲:+33。(0)1.3904.6880•日本:+81。(0)77.565.6999GydF4y2Ba
仅供研究使用。不用于诊断程序。©2021 Takara Bio Inc.保留所有权利。所有商标均为Takara Bio Inc.或其在美国和/或其他国家的关联公司或其各自所有者的财产。某些商标可能不会在所有司法管辖区注册。其他产品、知识产权和限制使用信息可在takarabio.com上获得。GydF4y2Ba