ICELL8 cx系统的基本细胞制剂gydF4y2Ba
本协议适用于使用标准培养基和培养容器悬浮培养的标准组织培养细胞。这些细胞可以培养到高密度,很容易通过离心获得。这类细胞的典型例子包括Jurkat和K562细胞。gydF4y2Ba
本协议的下游ICELL8 cx应用程序包括SMART Seq、3'DE和定制化学品。gydF4y2Ba
收集细胞gydF4y2Ba
- 从培养箱中取出组织培养容器并转移到标准无菌组织培养罩中。gydF4y2Ba
- 仔细旋转培养容器,形成均匀的细胞悬浮液。gydF4y2Ba
- 取下组织培养容器盖或盖,用10ml血清学吸管轻轻搅拌细胞悬液,以免损伤细胞。gydF4y2Ba
- 适当混合后,收集3- 4ml细胞悬液并转移到一个新的5ml管中。gydF4y2Ba
B.细胞计数gydF4y2Ba
- 用您喜欢的方法确定收集的细胞悬液中的细胞浓度。gydF4y2Ba
计算细胞数/ml,将含有250000个细胞的细胞悬液转移到一个新鲜的5ml试管中。gydF4y2Ba
注意:gydF4y2Ba待转移的最小细胞悬液体积应为1ml。如果细胞悬液的浓度大于250000个细胞/ml,则在将1ml转移至新鲜的5ml试管之前,将悬浮液稀释至250000个细胞/ml。如果细胞悬浮液的浓度大大低于250000个细胞/毫升,则可能需要将超过2.5毫升的体积转移到新的新鲜试管中,以转移250000个细胞。如果是这种情况,我们建议将细胞悬液转移到15ml锥形管中,而不是5ml管中。gydF4y2Ba
c .标签细胞gydF4y2Ba
注意:gydF4y2Ba我们推荐使用Invitrogen ReadyProbes细胞活力成像试剂盒,红色/蓝色,其中包含Hoechst 33342和碘化苯啶(Thermo Fisher Scientific;猫。# R37610)。gydF4y2Ba
为了检测ICELL8芯片中分配的细胞,必须对所有细胞进行两次标记:一次用不区分染色法,另一次用活性染色法区分活细胞和死细胞。Hoechst 33342是细胞可渗透的,并在活细胞中与dsDNA结合,而不管膜状态如何。碘化丙啶(PI)在细胞膜受损的死亡或凋亡细胞中会永久结合DNA。gydF4y2Ba
可在芯片中识别分配的双标记细胞如下:gydF4y2Ba
- 仅赫斯特阳性:活细胞gydF4y2Ba
- Hoechst和PI阳性:死细胞gydF4y2Ba
- 仅PI正极:碎屑gydF4y2Ba
根据细胞悬液的体积(见B节,步骤2),需要加入适量的Hoechst和PI染料。请遵循下表中所列的Hoechst 33342染料和PI染料体积的建议,以确保使用的每种染料体积都是正确的。将适当体积的Hoechst 33342和PI染料添加到含有细胞悬浮液的管中。gydF4y2Ba
细胞悬液体积(ml)gydF4y2Ba π卷(μl)gydF4y2Ba Hoechst 33342体积(μl)gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 80gydF4y2Ba 80gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 160gydF4y2Ba 160gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba 240gydF4y2Ba 240gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 320gydF4y2Ba 320gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 400gydF4y2Ba 400gydF4y2Ba 一旦加入这两种染料,用宽孔移液管或血清学移液管缓慢地上下移液混合细胞。gydF4y2Ba
重要的是:gydF4y2Ba不要使细胞悬液旋涡混合染料。gydF4y2Ba
用染料在37°C孵育细胞20分钟。gydF4y2Ba
准备标记细胞用于分配gydF4y2Ba
加入等量的冷1X PBS(不含钙或镁)稀释标记细胞悬液,并用宽孔吸管尖或血清学吸管缓慢地上下移液混合细胞。gydF4y2Ba
重要的是:gydF4y2Ba不要使细胞悬液旋转。gydF4y2Ba
4℃离心成球。gydF4y2Ba
注意:gydF4y2Ba最佳离心速度和时间因细胞类型而异。我们通过以下指南验证了本方案:gydF4y2Ba
细胞≥13μm:100gydF4y2BaggydF4y2Ba3分钟gydF4y2Ba
细胞≤12 μm: 500gydF4y2BaggydF4y2Ba3分钟gydF4y2Ba- 在不干扰细胞颗粒的情况下,轻轻地从离心机上取下试管,并使用宽孔移液管尖或血清学移液管小心地吸取上清液,而不干扰细胞颗粒。gydF4y2Ba
- 使用宽孔移液管尖端,轻轻添加1ml冰1X PBS到管侧壁。gydF4y2Ba
用同一针尖,缓慢地上下移液约5次,将细胞悬液轻轻混合。gydF4y2Ba
重要的是:gydF4y2Ba不要旋涡使颗粒重新悬浮。gydF4y2Ba
测定细胞悬液中的细胞浓度。gydF4y2Ba
重要的是:gydF4y2Ba配药前染色细胞悬液的推荐浓度范围为1.2-2.5 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/毫升。如果浓度低于1.2 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/ml,将染色的细胞悬液重新成球,用更小体积的1X PBS重悬,以达到推荐的浓度范围。gydF4y2Ba
- 将含有细胞悬液的试管置于建议浓度范围内,直接放在冰上。gydF4y2Ba
细胞悬浮液现在可以用于ICELL8 cx应用,如SMART-seq, 3' DE,或定制化学。gydF4y2Ba
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