结合PCR和NGS的能力来识别和描述病原体
疫情控制和疾病预防工作依赖于迅速识别和鉴定新的和现有的病原体,然后利用这些病原体开发新的和更好的检测方法。快速取得成果对于开发有效工具和部署这些工具以限制传染病的传播至关重要。除了需要快速的结果之外,研究具有挑战性的样本类型(例如,临床研究和环境样本往往包含非常低的拷贝数)的研究人员还需要高度敏感和准确的工具来检测和测序目标病原体。
实时定量PCR (RT-qPCR)和基于PCR的方法由于其效率、灵敏度和准确性,被广泛应用于与下一代测序(NGS)分析一起识别和描述病毒和细菌病原体。RT-qPCR已经用于检测和确认使用NGS技术获得的特定病毒序列的检测。多重PCR与NGS分析相结合也被用于检测致病菌。这些技术在涉及各种病毒、细菌和哺乳动物病原体的研究中发挥了关键作用。例如,对SARS-CoV-2病毒的初步识别和测序,对钩端螺旋体以了解其传播方式,并鉴定eb病毒(EBV)基因组突变可能导致慢性活动性EBV (CAEBV)和淋巴瘤。
识别和分类SARS-CoV-2
首次采用RNA-seq、一步RT-qPCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE)对新型冠状病毒SARS-CoV-2进行了鉴定和分类。首次发现这种新的RNA病毒的作者(Zhu et al. 2020)开发了一种使用Takara Bio的RT-qPCR筛选试验单步primer RT-PCR试剂盒(完美实时)检测通过RNA-seq分析病毒获得的特定病毒序列。作者进行了全长系统发育分析,结果表明SARS-CoV-2与在蝙蝠中检测到的一些β-冠状病毒相似,但不同于SARS-CoV和MERS-CoV,这两种先前发现的冠状病毒可导致人类严重呼吸系统疾病。
![images/900-Special_Topics/912-Coronavirus/AA-EyeCandy/coronavirus-2019-nCoV-8881-iE.jpg SARS-CoV-2](http://www.yamajr.com/areas-of-interest/pathogen-detection/images/900-Special_Topics/912-Coronavirus/AA-EyeCandy/coronavirus-2019-nCoV-8881-iE.jpg)
另一项研究(Wu et al. 2020)也使用RNA-seq确定了SARS-CoV-2的病毒基因组序列,并使用RT-qPCR进行了证实。下一代元转录组测序分析使研究人员能够获得完整的病毒基因组序列。该小组随后进行的系统发育分析也表明,该病毒与此前在中国蝙蝠中发现的一组sars样冠状病毒关系最密切.这些分析部分通过Takara Bio产生的试剂盒和试剂来实现:使用RNA文库使用我们的微输入链特异总rna测序技术,通过使用一步PrimeScript RT-PCR试剂盒(完美实时)进行RT-qPCR来确定和确认病毒基因组序列,并更聪明的比赛5'/ 3'套件用来研究基因组终结。
另一篇论文(Zhou et al. 2020)使用了基于NGS和pcr的方法进行了宏基因组分析,在全基因组水平上确定了该病毒与蝙蝠冠状病毒的96%相同。该小组还使用SMARTer RACE 5'/3'试剂盒来确定基因组的5'端。对7个保守非结构蛋白的两两序列分析表明,该病毒属于sars冠状病毒属。他们还证实,SARS-CoV-2与SARS-CoV使用相同的细胞进入受体ACE2,这已被证明在开发对抗COVID-19大流行的治疗方法和疫苗的探索中至关重要。
调查钩端螺旋体病在环境中的传播
钩端螺旋体病是一种由钩端螺旋体通过接触携带这些细菌的动物尿液或受污染的环境样本而感染人类的细菌。日本冲绳的一个研究小组(Sato et al. 2019)试图开发新的系统检测工具钩端螺旋体以防止人类感染。他们研究了细菌生态系统钩端螺旋体通过使用多重PCR和NGS分析各种环境样本,研究哪些动物是将该病原体传播给人类的潜在宿主。
![](http://www.yamajr.com/areas-of-interest/pathogen-detection/images/900-Special_Topics/908-Areas-of-Interest/CC-TechFigs/Leptospira_bacteria_8957.jpg)
研究人员从日本的已知流行区域筛查了rRNA靶标的环境水样品钩端螺旋体和住在附近的动物。它们进行了多重PCR分析豆类Taq交货HS DNA聚合酶使用16S rRNA靶标检测细菌,它们通过NGS分析。使用类似的程序PrimeSTAR HS DNA聚合酶检测同一环境样本中脊椎动物的12S rRNA,以了解哪些物种更有可能藏匿钩端螺旋体.某些动物的出现似乎与高水平的钩端螺旋体,显示了病原体和携带者之间的潜在联系。他们能够绘制出致病性细菌菌株之间的相关性钩端螺旋体以及这些细菌的主要宿主动物。本研究证明了Takara的稳健性Taq交货HS和PrimeSTAR HS DNA聚合酶检测环境水样中的细菌,由于存在聚合酶链反应抑制污染物,很难处理。该研究中使用的多重PCR方法是一个帮助确定如何使用的强大工具钩端螺旋体暴发可能会发生,揭示病原体、宿主/携带者和环境之间的相互作用。
定位与caebv相关淋巴瘤相关的EBV基因组缺失
Epstein-Barr病毒(EBV)估计通过唾液的蔓延来感染全球范围内的95%的人口。在大多数情况下,EBV感染不会显示任何症状,或者在永久性休眠之前会导致传染性单核细胞增多症。然而,在一些罕见的病例中,病毒仍然活跃,导致Caebv(慢性活性EBV)。EBV是一种致癌疱疹病毒,优先感染B细胞,较少,T和NK细胞,导致Hodgkin的淋巴瘤,舒适的淋巴瘤,上皮癌和慢性感染患者时的其他恶性肿瘤。
![images/900-Special_Topics/910-BioView_Blog/AA-EyeCandy/Epstein-barr_virus_8682_iG_200.png 巴尔病毒](http://www.yamajr.com/areas-of-interest/pathogen-detection/images/900-Special_Topics/910-BioView_Blog/AA-EyeCandy/Epstein-barr_virus_8682_iG_200.png)
来自日本几所大学的研究人员对CAEBV的起源以及导致肿瘤和淋巴瘤发展的基因组突变进行了合作调查(Okuno等,2019年)。他们进行了高保真的远程PCRPrimeSTAR GXL聚合酶与Sanger和深度测序相结合,探讨了不同Caebv相关淋巴瘤患者EBV基因组中的腺体缺失。研究人员确定了可以与恶性肿瘤联系的MicroRNA簇和病毒颗粒生产基因中的缺失,但在表现出传染性单核细胞增多症的患者中没有发现EBV基因组缺失。基氨基术GXL聚合酶在帮助本研究中验证用NGS观察到的腺体缺失作用至关重要的作用,因为它经过优化,以便与长扩增子和挑战(富含GC或富含GC)的模板进行良好。PCR分析使用稳健的可靠聚合酶,例如Primestar GX1对于确认用NGs观察到的致病性突变,插入和缺失是至关重要的。
参考
- Okuno Y。et al。慢性活性感染和血液恶性恶性肿瘤中缺陷的Epstein-Barr病毒。微生物。4, 404 - 413(2019)。可以在:https://www.nature.com/articles/s41564-018-0334-0.
- 佐藤,Y。et al。日本钩端螺旋体流行区致病性钩端螺旋体及其相关生物的环境DNA元编码检测代表。91 - 11(2019)。可以在:https://www.nature.com/articles/s41598-019-42978-1
- 吴,F.et al。一种与中国人类呼吸道疾病相关的新型冠状病毒。自然界579,265-269(2020年)。可以在:https://www.nature.com/articles/s41586-020-2008-3
- 周,P。et al。发现一种与最近人类肺炎暴发有关的新型冠状病毒及其可能的蝙蝠来源。bioRxiv01.22.914952(2020)。可以在:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.22.914952v2
- 朱,N。et al。一种新型冠状病毒来自2019年中国肺炎患者。心血管病。j .地中海。NEJMoa2001017(2020)。doi:https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa2001017
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