癌症研究样本准备:FFPE组织
几十年来,病理学家的标准做法是从癌症患者的肿瘤中获取组织活检,将其固定在甲醛(也称为福尔马林)中,然后脱水并将固定的组织包埋在石蜡块中。这种制剂允许福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)将样品切成薄片,可安装在显微镜载玻片上,并采用免疫组织化学等技术进一步分析细胞形态、蛋白质表达等。这种方法也使样品适合在环境条件下长期储存。因此,临床和研究机构世界各地的研究机构已经积累了大量FFPE样本库,这些样本库与相关患者数据相结合。这些样本库对于寻求进行大规模分析以阐明癌症分子机制的研究人员来说是非常宝贵的(Fairley et al.2012)。
虽然FFPE组织的生物库为癌症研究人员提供了重要的资源,但从这些样本中获得足够产量的DNA和RNA以进行下游分析并非易事。固定会导致核酸片段化,核酸和蛋白质之间形成交联,并引入核酸otide的变化,这共同阻碍了下游分析的执行。已经针对FFPE样品开发了多种核酸纯化方法,产生适合PCR和NGS等应用的输出,以克服这些障碍。
请注意,machery - nagel核酸纯化产品仅在北美、印度和日本的Takara Bio提供。
重点产品
DNA纯化
Takara Bio提供了基于硅胶膜和磁珠的技术,用于从大量FFPE样品中纯化DNA核自旋DNA-FFPE-XS和核衣壳DNA试剂盒。这两种技术都使用无味、无毒、无二甲苯的试剂来去除石蜡。然后用蛋白酶处理样品,使固定的组织溶解,并将DNA释放到溶液中,然后在特殊配方的缓冲液中进行热培养,以消除交联。然后将裂解物DNA结合到二氧化硅膜上r顺磁珠,经过连续清洗步骤并洗脱。尽管NucleoSpin FFPE DNA试剂盒以单制备和多制备形式提供,以满足不同的吞吐量需求,但NucleoMag FFPE DNA试剂盒主要用于自动化、高通量处理。
图1所示。由于使用NucleoSpin DNA FFPE XS能有效地回收解交联DNA,所以具有出色的PCR性能。用NucleoSpin DNA FFPE XS (2x蓝色图)和竞争对手Q的FFPE迷你洗脱试剂盒(2x橙色图)从FFPE大鼠肝组织中分离DNA,使用Roche LightCycler系统PCR扩增100 bp的靶标。与竞争对手Q的试剂盒相比,NucleoSpin DNA FFPE XS的产量始终较高,且DNA具有更好的PCR性能。为了进行比较,起始样品是经过过夜裂解并以30µl洗脱的FFPE组织的一个切片。
RNA净化
为了从FFPE样品中纯化总RNA, Takara Bio提供了基于二氧化硅膜的技术,其设计为不同输入量的单准备格式:核自旋totalRNA FFPE和核自旋totalRNA FFPE XS. 在脱蜡、蛋白酶处理和加热之后,将裂解物在能够结合多种RNA物种(包括小RNA)的条件下应用于膜。剩余的DNA然后通过柱上DNA酶处理进行消化,在连续的洗涤步骤后,RNA在小体积的无RNA酶水中洗脱,产生高浓度的RNA。
图2.与竞争试剂盒相比,核自旋totalRNA FFPE提供了更高的RNA产量,如qPCR所确定。总RNA分离出4 x 10µm厚FFPE部分小鼠脑组织的NucleoSpin totalRNA FFPE和三个竞争对手包(Q, A, P)。mRNA和MicroRNA的目标被qPCR放大(mRNA的目标由230元部分的β2-microglobulin基因,而MicroRNA的目标进行了分析使用miR-16 TaqMan MicroRNA化验。(注意:使用Thermo Fisher Scientific的TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒分别对miRNA样本进行反转录。)使用MN试剂盒处理的样本观察到的较低CT值表明,相对于竞争对手的试剂盒,MN试剂盒提供了更高的RNA产量。
参考
Fairley, j . A。等充分利用病理标本:福尔马林固定石蜡包埋组织的分子诊断。当前药物靶点13,1475–1487 (2012).
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