AD研究样品准备:FFPE组织
将脑组织与甲醛(也称为福尔马林)固定,然后是组织脱水并将其嵌入石蜡块中,是近一个世纪的常用方法。这种方法使组织显着稳定,允许在环境条件下的阿尔茨海默氏症和控制组织的长期储存(几年到数十年)。这些FFPE嵌段与蛋白质表达和细胞形态的免疫组织化学分析高度相容,结果,研究和临床机构积累了数千种样品的人体组织的巨大生物汉。这些样品可跨越几十年,与相关的遗传,临床,诊断数据相关联。特定的CNS研究人员的实用性是组织块可以由神经杀菌区域分类,了解阿尔茨海默病的进展和影响的关键考虑因素。
虽然FFPE组织提供了一个令人难以置信的有价值的研究工具,但固定过程会导致大量的核酸/蛋白质交联,DNA和RNA碎片,以及碱的脱氨基和/或氧化,呈现FFPE样本DNA和RNA的挑战来源。幸运的是,已经为来自FFPE样品的核酸提取而开发了专门的方法,其产生适合于PCR和下一代测序等应用的产量。
请注意,machery - nagel核酸纯化产品仅在北美、印度和日本的Takara Bio提供。
突出显示的产品
DNA纯化
Takara Bio提供基于二氧化硅膜和磁珠的技术,用于从广泛的FFPE组织类型的DNA纯化NucleoSpin FFPE DNA XS和NucleoMag DNA FFPE板。这两种技术都使用了无味、无毒、无二甲苯的试剂来去除石蜡。然后用蛋白酶处理样品,使固定的组织溶解,并将DNA释放到溶液中,然后在特制的缓冲液中热培养以消除交联。裂解DNA然后结合到二氧化硅膜或顺磁珠上,经过顺序洗涤步骤,然后洗脱。NucleoSpin FFPE DNA试剂盒以单预和多预的形式提供,以满足不同的吞吐量需求,而NucleoMag FFPE DNA试剂盒主要用于自动化、高通量处理。
![展示了我们的NucleoMag和NucleoSpin试剂盒从FFPE组织中提取DNA的卓越产量和性能。](http://www.yamajr.com/areas-of-interest/alzheimers-disease-research/images/900-Special_Topics/908-Areas-of-Interest/CC-TechFigs/PCR-perf-NucleoSpinDNA-FFPE_T.gif)
图1.用核磷脂DNA FFPE试剂盒的去交联DNA的突出产量和PCR性能。面板A.用NucleoMag DNA FFPE从1片小鼠FFPE组织切片/标本(每种组织类型4份标本)中分离DNA。DNA产量(深蓝色条)通过光密度进行定量,qPCR分析(橙色方块)使用Thermo Fisher Scientific Maxima SYBR Green qPCR Master Mix进行。面板B.用NucleoSpin DNA FFPE XS (2x蓝色图)和竞争对手Q的FFPE迷你洗脱试剂盒(2x橙色图)从FFPE大鼠肝组织中分离DNA,使用Roche LightCycler系统PCR扩增100 bp的靶标。与竞争对手Q的试剂盒相比,NucleoSpin DNA FFPE XS的产量始终较高,且DNA具有更好的PCR性能。为了进行比较,起始样品是经过过夜裂解并以30µl洗脱的FFPE组织的一个切片。
RNA净化
为了从FFPE样品中纯化总RNA, Takara Bio提供了基于二氧化硅膜的技术,其设计为不同输入量的单准备格式:NucleoSpin totalRNA FFPE和核ospin总rna ffpexs.以下脱蜡,蛋白酶处理,并加热,将溶胞产物,使不同的RNA物质,包括小RNA结合的条件下施加到膜。残留DNA然后通过一个柱上DNA酶处理消化,以下连续的洗涤步骤,RNA洗脱在不含RNA酶的水的小体积,从而产生具有优越的产率高度浓缩的RNA,并降低的gDNA污染比竞争对手的试剂盒(图2)。
![Nucleospin总RNA FFPE提供高RNA产率和从脑组织相对于竞争对手的试剂盒提供较低的DNA污染。](http://www.yamajr.com/areas-of-interest/alzheimers-disease-research/images/900-Special_Topics/908-Areas-of-Interest/CC-TechFigs/NucleoSpin_totalRNA_FFPE_T.gif)
图2。与竞争对手的试剂盒相比,NucleoSpin totalRNA FFPE提供更高的RNA产量和更低的脑组织DNA污染。用NucleoSpin totalRNA FFPE (MN)和3个竞争试剂(Q, A, P)从4个10µm厚的小鼠脑组织FFPE切片中分离总RNA。面板A.通过QPCR(mRNA靶标由β2-微球蛋白基因的230-nt部分组成的mRNA和miRNA靶标,而使用MIR-16 Taqman MicroRNA测定分析miRNA靶标。(注意:MiRNA样品分别逆转录使用Thermo Fisher Scientific的Taqman MicroRNA逆转录套件。)面板B.通过扩增191-BP片段来测定残留的DNAmGAPDH基因。对于两种测定,观察到用核阶素TotalRNA FFPE试剂盒加工的样品观察到的下部CT值提供了较高的RNA产率和相对于竞争对手的套件的DNA污染。
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