用于癌症治疗/药物发现的基因编辑
CRISPR/Cas9基因编辑已经成为编辑许多不同生物体基因组的一种强有力的方法。CRISPR/Cas9最初是作为适应性免疫系统的一部分在细菌中发现的,其及其修改版本现在被广泛用于基因组工程和激活或抑制特定基因的表达。此外,CRISPR/Cas9基因编辑有望通过提供一种有效的技术来解剖肿瘤发生机制,识别药物开发的靶点,以及可能用于细胞疗法的臂细胞,从而加速癌症研究(Moses et al. 2018)。
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癌症治疗
基因组编辑方法在靶向、位点特异性癌症治疗方面具有巨大的潜力。人类乳头瘤病毒(HPV)基因E6和E7通过扰乱正常的细胞周期和肿瘤抑制功能来抵抗细胞死亡。Cas9-mediated人乳头状瘤病毒E7癌基因破坏导致显著抑制hpv诱导的癌活性在体外和在活的有机体内,老挝等人,2018年。作者使用了我们的指南-突变检测试剂盒和指南-它Indel鉴定包检查基因编辑是否有效。
基因组编辑方法在癌症免疫治疗中也显示出了有希望的结果,以对抗癌症逃避免疫破坏的特点。修饰的嵌合抗原受体(CAR) T细胞已经产生,以改善癌症的靶向和破坏。通过Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物也可以在T细胞中进行敲入基因组修饰。Kagoya等人,2018年报道了这种抑制DOT1L,一种组蛋白h3 -赖氨酸79甲基转移酶,减轻异体t细胞反应。作者使用了探索sgRNA在体外转录工具包和指南-it重组Cas9(电穿孔准备)crispr介导的CAR-T细胞的TCR消融。通过电穿孔RNP复合物,它们在CAR-T细胞中可以达到~30%的TCR敲除效率。
在最近发表在《自然》杂志上的一项开创性研究中,Alexander Marson教授和他的同事描述了一种高效的t细胞工程方法,通过将Cas9-sgRNA RNP复合物与双链DNA或其他DNA串联电孔,绕过病毒传递,最大限度地减少细胞毒性单链DNA (ssDNA) HDR模板(Roth等人,2018年)。
药物发现
全基因组敲除筛选是一个强大的功能基因组学工具,以发现新的药物靶点的癌症治疗。对于CRISPR/Cas9的联合敲除筛选,需要生成具有多种基因敲除的细胞群。编码sgRNA库的慢病毒颗粒被用来以低多重感染的方式感染cas9表达的细胞,这样每个细胞都可能携带一个独特的sgRNA盒和特定的基因敲除。随后,这些敲除细胞池暴露于选定的干扰,然后与参考对照细胞群进行NGS分析。通过这种方法,有可能监测细胞群体中特定基因敲除的表型效应。
的指南- CRISPR全基因组sgRNA文库系统是一个以整个人类基因组为敲除筛选目标的慢病毒sgRNA库,因此是发现癌症治疗新药物靶点的理想工具(图1).该文库包含来自Brunello文库的sgRNAs,基于每个基因的优化引导序列的最新算法(Doench et al. 2016, Doench et al. 2018):
•每个基因有四个引导子
•共76,610份指南(包括172份阴性对照)
•19,114个基因
图1所示。6-硫鸟嘌呤抗性聚合sgRNA文库的筛选示意图。
参考文献和产品引用
Doench j·G。et al。优化sgRNA设计,使CRISPR-Cas9活性最大化,脱靶效应最小化。生物科技Nat。》。34岁,184 - 191(2016)。
Doench j·G。et al。我准备好CRISPR了吗?基因筛选的用户指南。Nat,启麝猫。19,67 - 80(2018)。
Kagoya Y。et al。在过继免疫治疗模型中,DOT1L抑制减弱异体T细胞介导的移植物抗宿主病。Nat。通信9,1915(2018)。
老挝y . H。等.利用非病毒递送CRISPR/Cas9或gregory钠杆菌操纵HPV致癌基因。放置科学。1700540(2018)。
摩西C。等.癌症的特征:CRISPR的一代。欧元。j .癌症93年,10 - 18(2018)。
罗斯,t . L。et al。用非病毒基因组靶向重新编程人类T细胞功能和特异性。Nat。。559年,405 - 409(2018)。
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