AD研究标本准备:FFPE组织
用甲醛(也称为福尔马林)固定脑组织,然后组织脱水并包埋在石蜡块中,是一种常用的保存方法,已经使用了近一个世纪。这种方法使组织非常稳定,允许长期储存(几年到几十年)阿尔茨海默病,并在环境条件下控制组织。这些FFPE块与蛋白表达和细胞形态的免疫组化分析高度兼容,因此,研究和临床机构积累了大量的人体组织生物库,可能包括数千个样本。这些样本可以跨越几十年,并与相关的遗传、临床和诊断数据相关联。对中枢神经系统研究人员来说,特别有用的是组织块可以按神经解剖区域分类,这是理解阿尔茨海默病进展和影响的关键考虑因素。
虽然FFPE组织提供了一个极有价值的研究工具,但固定过程会导致广泛的核酸/蛋白质交联、DNA和RNA片段以及碱基的脱氨和/或氧化,使FFPE样品成为具有挑战性的DNA和RNA来源。幸运的是,已经开发出了从FFPE样品中提取核酸的专门方法,这些方法产生的结果适用于PCR和下一代测序等应用。
请注意,machery - nagel核酸纯化产品仅在北美、印度和日本的Takara Bio提供。
突出产品
DNA纯化
Takara Bio提供基于二氧化硅膜和磁珠的技术,用于从广泛的FFPE组织类型的DNA纯化Nucleospin DNA FFPE Xs和NucleoMag DNA FFPE板。这两种技术都使用了无味、无毒、无二甲苯的试剂来去除石蜡。然后用蛋白酶处理样品,使固定的组织溶解,并将DNA释放到溶液中,然后在特制的缓冲液中热培养以消除交联。裂解DNA然后结合到二氧化硅膜或顺磁珠上,经过顺序洗涤步骤,然后洗脱。NucleoSpin FFPE DNA试剂盒以单预和多预的形式提供,以满足不同的吞吐量需求,而NucleoMag FFPE DNA试剂盒主要用于自动化、高通量处理。
![展示了我们的NucleoMag和NucleoSpin试剂盒从FFPE组织中提取DNA的卓越产量和性能。](http://www.yamajr.com/applications/alzheimers-disease-research/images/900-Special_Topics/908-Areas-of-Interest/CC-TechFigs/PCR-perf-NucleoSpinDNA-FFPE_T.gif)
图1所示。用NucleoSpin DNA FFPE试剂盒解交联DNA的优异产量和PCR性能。面板。用NucleoMag DNA FFPE从1片小鼠FFPE组织切片/标本(每种组织类型4份标本)中分离DNA。DNA产量(深蓝色条)通过光密度进行定量,qPCR分析(橙色方块)使用Thermo Fisher Scientific Maxima SYBR Green qPCR Master Mix进行。小组B.用NucleoSpin DNA FFPE XS (2x蓝色图)和竞争对手Q的FFPE迷你洗脱试剂盒(2x橙色图)从FFPE大鼠肝组织中分离DNA,使用Roche LightCycler系统PCR扩增100 bp的靶标。与竞争对手Q的试剂盒相比,NucleoSpin DNA FFPE XS的产量始终较高,且DNA具有更好的PCR性能。为了进行比较,起始样品是经过过夜裂解并以30µl洗脱的FFPE组织的一个切片。
RNA净化
为了从FFPE样品中纯化总RNA, Takara Bio提供了基于二氧化硅膜的技术,其设计为不同输入量的单准备格式:NucleoSpin totalRNA FFPE和核ospin总rna ffpexs.在羟烷化,蛋白酶处理和加热之后,在能够结合不同RNA物种的条件下施加裂解物,包括小RNA。然后通过柱状DNA酶处理来消化残留的DNA,并且在连续的洗涤步骤之后,在少量的无RNase水中洗脱RNA,得到高度浓缩的RNA,比竞争对手的套件更高的产量和更低的GDNA污染(图2)。
![与竞争对手的试剂盒相比,核旋蛋白总RNA FFPE提供高RNA产量和脑组织DNA污染低。](http://www.yamajr.com/applications/alzheimers-disease-research/images/900-Special_Topics/908-Areas-of-Interest/CC-TechFigs/NucleoSpin_totalRNA_FFPE_T.gif)
图2。与竞争对手的试剂盒相比,NucleoSpin totalRNA FFPE提供更高的RNA产量和更低的脑组织DNA污染。用NucleoSpin totalRNA FFPE (MN)和3个竞争试剂(Q, A, P)从4个10µm厚的小鼠脑组织FFPE切片中分离总RNA。面板。通过qPCR扩增mRNA和miRNA靶点(mRNA靶点由β2-微球蛋白基因的230-nt部分组成,miRNA靶点使用miR-16 TaqMan MicroRNA Assay分析。(注:miRNA样本分别用Thermo Fisher Scientific的TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒进行逆转录。)小组B.通过扩增一个191bp的片段来检测残留的DNAmGAPDH基因。对于这两种检测方法,与竞争对手的试剂盒相比,使用NucleoSpin totalRNA FFPE试剂盒处理的样品所观察到的较低的CT值提供了更高的RNA产量和更低的DNA污染。
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