插入、删除和替换,天哪-定点突变引物的设计
你的诱变方法在富含气相色谱的模板中表现不好吗?你得到的殖民地是太少还是太多,没有你想要的突变的殖民地,还是根本没有殖民地?可悲的是,这些问题已经困扰研究人员几十年了。
你会很高兴知道有一个解决方案,它开始和结束于“在融合“In-Fusion是市场上性能最好的无缝克隆产品,但你知道你也可以使用该技术进行定点诱变吗?
In-Fusion Cloning产品提供了使用任何载体产生单个或多个碱基变化、缺失和插入的灵活性,准确率超过95%——通过结合In-Fusion克隆技术的力量和高保真反PCR,使用的聚合酶与富含gc的模板很好地工作。
融合克隆位点定向突变的协议是什么?
在融合系统中进行反向PCR时,引物在循环克隆载体上的方向相反(图1)。要进行突变,请设计PCR引物,使它们在5'端彼此重叠15 bp,并结合感兴趣的突变,并使用高保真PCR聚合酶,如PrimeSTAR Max DNA聚合酶,它在富含gc的模板上显示出最小的错误率。
想要了解细节吗?请参阅我们的突变与融合克隆技术笔记!
如何设计位点定向诱变的In-Fusion引物?
我们的在线底漆设计工具只需输入载体和插入物的DNA序列,即可为定点诱变实验设计引物。它允许您指定要删除的确切核苷酸,在您想要的插入位点添加您选择的载体序列,输入替换序列(独立于限制位点),并根据您的设计下载引物和PCR信息。使用我们的工具和下面的指导方针,注意可以使用专门的教程来设计初级生成器删除,插入,替换.
底漆设计的一般指导原则
- 每个PCR引物应在圆形载体模板上引导相反方向的DNA合成。
- 正、反PCR引物的3'端应与模板互补18-25 nt,以保证高效特异性扩增。
- 突变应包含在位于正向和反向PCR引物5'末端的同源15 nt重叠处(这种同源重叠是突变载体的再循环所必需的)。
- 单个或多个碱基的变化、缺失或插入可以在单个in - Fusion反应中引入。
- 通过将正向引物和反向引物的3'端定位在缺失位点的边缘位置,也可以引入任意长度的更大的缺失,其中任何一个引物的5'端都带有同源的悬垂物。
逆转录聚合酶链反应将产生一个两侧末端互补并携带15 nt同源重叠的线性双链载体。这种重叠将通过In - Fusion反应结合起来,并在In - Fusion反应中恢复大肠杆菌,从而产生突变的载体。反PCR扩增的载体可以用克隆增强子破坏亲代载体,直接用于in - fusion反应。
我如何从任何向量中删除一个特定的序列?
使用引物设计工具(在“项目类型”下选择“诱变”)和“删除序列”教程设计PCR引物:
- 删除选定向量中的特定基或序列
- 指定要删除的确切核苷酸
- 生成并下载设计的引物和PCR信息
如何将一个特定序列插入到任意向量中?
简单地使用工具与“插入序列”教程设计引物:
- 添加您选择的向量序列
- 选择插入位点(不依赖于限制位点)并指定要添加的确切核苷酸
- 根据你的设计下载引物和PCR信息
我如何删除和替换任何向量中的序列?
再一次,用这个工具“删除和替换任意向量中的序列”教程设计引物:
- 添加您选择的向量序列
- 指定要删除的确切的核苷酸
- 输入替换顺序
- 根据你的设计下载引物和PCR信息
使用In-Fusion for诱变,您现在有勇气和信心克服定点诱变的挑战,并且您将永远不会回头使用此强大、精确的工具,使用您选择的载体进行更快、更容易和更准确的定点诱变。
从任何向量中删除特定序列
设计引物,从你选择的任何位点的载体上删除核苷酸。
在任意向量中插入特定序列
设计引物来添加核苷酸,比如小标签或结构域,到你选择的任何位点的载体上。
删除和替换任意向量中的序列
设计引物,在你选择的载体的任何位点上同时删除和替换核苷酸(例如,用于域交换研究)。
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