揭示了微生物的世界
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微生物无处不在,但直到最近,我们只能在培养样本中单独研究它们。宏基因组学开创了微生物研究的新纪元;现在,我们可以在它们的自然环境中对它们进行整体检查。
通过在混合群体中允许靶向或未明确的表征而没有偏差,偏离靶或未出现的特征,Metagenomic Ngs(MNGs)。未确定的MNG使用纯微生物培养样品的霰弹枪测序,从中测定DNA或RNA的随机样品。相反,有针对性的方法仅限于使用16S rRNA扩增,单次或多重PCR,底漆延伸或诱饵探针富集方法(Wei,Miller和Chiu 2019)的特定物种或地区的检测。
由于病原体对宿主的基因组比率非常低,患者样本的散弹mNGS就陷入了“大海捞针”的困境。由于使用该方法的>99%的reads来自人类宿主,其病原菌检测灵敏度明显有限。靶向测序或宿主耗尽法通过减少背景序列(宿主gDNA、rRNA或线粒体RNA)相对于非人类微生物阅读的相对比例来克服这一障碍。因此,这些方法有可能提高病原菌检测的分析灵敏度,同时保留了无偏mNGS的优势,因为它们不知道所寻找的病原菌。
解开宏基因组学方法的结
在一个有趣的研究来自瑞士伯尔尼大学的研究人员建立了一个简单的散管mNGS工作流,以最小化压倒性的宿主核酸(NA)背景,允许同时筛查脑脊液(CSF)样本中的细菌和病毒。为了减少宿主NA的比例,并在患者样本中丰富病毒和细菌的NA,他们开发了一种简单的NA耗尽方法。
宿主Na耗尽过程包括选择性宿主细胞裂解,释放的基因组DNA的酶促降解,以及具有顺磁珠的最终耗竭。用逆转录,全基因组扩增使用PicoPLEX WGA的工具包,然后是NGS。首先,他们在添加了三种1:100稀释的甲型H3N2流感病毒的替代CSF样本上验证了他们的工作流程的有效性。接下来,他们在代理脑脊液样本测试工作流飙升甲型流感病毒和细菌为了测试同时RNA和DNA检测(图1)。工作流还测试了在13 meningo - /脑炎患者脑脊液样本(两个细菌,病毒病因11),安第斯山脉的血清病毒感染,和普通感冒病人的鼻拭子。这些患者样本的宿主耗尽并没有导致更多的读取,这表明可能由于宿主免疫反应而存在受损病原体,但在耗尽的样本和本地样本中检测到以前诊断的病原体。
图1所示。之后的放大方法比较用作者的核酸耗尽法进行宿主核酸(NA)的耗尽。数据显示了两种检测方法,全转录组扩增(WTA)或逆转录和全基因组扩增(RT-WGA),对含有RNA病毒流感病毒a H3N2 (Inf a)和细菌的宿主na耗尽的替代CSF样本进行了比较y伪(Y. Pseud.).RT-WGA协议结合了一个普通的逆转录试剂盒和PicoPLEX WGA的工具包。面板。QPCR结果宿主Na耗尽样品。引物探针目标在X轴上列出。Y轴表示循环阈值(CT值),表示宿主NA拷贝数的近似10倍。面板B。宏基因组学分析发现,在Inf A中,RT-WGA方法的reads比例低于WTA方法。相反的是y伪善者。,但程度较轻。面板C。Inf A和y伪善者。而RT-WGA产生的最大覆盖深度较高(小组D.;粉红色和黄色的酒吧)。图是由oechslin等人组成的。2018年在创造性的公共许可下(CC 4.0).
拉出右侧的弦:未来的方向
由于现有的宿主耗尽方法耗时、昂贵和/或高度专业化,本研究的作者希望开发适合于临床液体样本的自己的方法。提出的宿主NA清除方法是直接的,只需要10分钟的操作时间和50分钟的孵育时间,它成功地增加了替代CSF样本中的病毒和细菌阅读量。当与敏感的全基因组扩增方法(如PicoPLEX WGA Kit)结合时,它可以成为检测宿主样本中细菌DNA的强大工具。虽然这项技术的有效性受到几个因素的阻碍,包括低浓度的病原体,大量的污染和处理,以及生物信息学分析参考数据库的范围,但该工作流比以前的方法有了巨大的改进,并且稍加调整,将为临床样本分析铺平道路。
参考文献
Oechslin, c·P。et al。宿主衰竭后的散弹宏基因组学与低浓度替代样本和临床样本中病毒和细菌的常规诊断的有限相关性前面。细胞。感染。Microbiol。8(2018)。
GU,W.,Miller,S.和Chiu,C. Y.临床偏见的下一代测序用于病原体检测。为基础。启分册。14,319 - 338(2019)。
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